Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

אנו אסירי תודה לב' לאדו ולר'-מ'. מעבדת Mège לשימוש בציוד מנקה ה-UV שלהם, ו-J. Heuvingh ו-0. du Roure עבור האימון הראשוני שקיבלנו על הכנת תבניות על פרוסות סיליקון ומתן טיפים על microfluidics. אנו מכירים במימון מענק StG-679116 של מועצת המחקר האירופית (ל-A.J.) ומ-Agence Nationale de la Recherche מעניקים מוסקטין וקונפומין (ל-G.R.-L.).

1. הכנת תא מיקרופלואידי
<ol><li>בחר תבנית אב SU-8 עם מספר תבניות תא. תאים טיפוסיים הם בצורת צלב עם שלושה כניסות ושקע אחד, 20 מיקרומטר גובה ו-800 מיקרומטר רוחב (איור 1). תבניות מאסטר כאלה ניתן לרכוש מחברות חיצוניות או לעשות במעבדות אקדמיות (למשל, Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

בהשוואה לשיטות סטנדרטיות של נימה יחידה שבהן חוטי אקטין מעוגנים לפני השטח על ידי נקודות מרובות לאורכם או נשמרים קרוב אליו על ידי חומר צפיפות כגון מתילצלולוז, מיקרופלואידיקה מציעה מספר יתרונות. מכיוון שהאינטראקציות עם פני השטח הן מינימליות, נמנעות ההפסקות המלאכותיות שאינטראקציות אלה יכול...

ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין ורשתות חוטי אקטין נשלטים על ידי מספר תגובות ביוכימיות ותלויים בהקשר המכני. על מנת לקבל תובנה על מנגנונים מורכבים אלה, זה לא יסולא בפז כדי להיות מסוגל לצפות בתגובות בודדות על חוטים בודדים (במספרים גדולים מספיק). במהלך העשורים האחרונים, התצפית על חוטי אקטין דינמיים בזמן אמת, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), התגלתה כטכניקה מרכזית וסיפקה רשימה מרשימה של תוצאות שלא ניתן היה להשיג באמצעות בדיקות ביוכימיות של תמיסה בתפזורת1.
כדי להשיג זאת, יש לשמור על חוטי אקטין בעלי תווית פלואורסצנטית קרוב לפני השטח של כיסוי המיקרוסקופ תוך חשיפתם לתמיסות של חלבונים קושרי אקטין (ABPs), שגם אותם ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי. פעולה זו מספקת אמצעי לניטור אירועים המתרחשים על חוטים בודדים בתנאים ביוכימיים מבוקרים היטב, ובכך לכמת את שיעורי התגובה. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות ספציפיות. שמירה מלאכותית על חוטים קרוב לפני השטח, לעתים קרובות הודות לנקודות עיגון מרובות או על ידי שימוש בחומר צפיפות כגון מתילצלולוז, יכולה לשנות את התנהגותם (למשל, לגרום להפסקות בפילמור ובדה-פולימריזציה שלהם2). מעקב אחר קווי המתאר של כל נימה יכול להיות מאתגר, במיוחד אם חוטים חדשים או שברי חוטים מצטברים בשדה הראייה לאורך זמן. התגובות מתרחשות בנפח סופי שבו הריכוז של מונומרים של אקטין ו-ABPs יכול להשתנות עם הזמן, מה שעלול להקשות על הפקת קבועי קצב מדויקים. לבסוף, קשה להשיג חידוש או שינוי של הפתרון של ABPs בפחות מ-30 שניות ולעתים קרובות יוביל לתכולת חלבון לא הומוגנית במדגם.
לפני קצת יותר מ-10 שנים, בהשראת מה שכבר נעשה כדי לחקור גדילים בודדים של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA)3, הצגנו טכניקה חדשה המבוססת על מיקרופלואידיקה כדי לבחון ולתפעל חוטי אקטין בודדים4. זה מאפשר לעקוף את המגבלות הנ"ל של טכניקות קלאסיות של נימה אחת. במבחני מיקרופלואידיקה אלה, חוטי אקטין גדלים מזרעי ספקטרין-אקטין הנספגים על הכיסוי. החוטים מעוגנים אפוא בקצה אחד בלבד לתחתית התא המיקרופלואידי ונעים מעל פני השטח מבלי להידבק. חוטים מתיישרים עם זרימת הפתרונות הנכנסים, ובכך מקלים על ניטור אורך קווי המתאר שלהם ושומרים עליהם באזור רדוד מעל הכיסוי שבו ניתן להשתמש ב- TIRF. פתרונות שונים זורמים בו זמנית לתוך התא ללא ערבוב, ואת החוטים ניתן לחשוף אותם ברצף ובמהירות.
כאן אנו מציעים סדרה של פרוטוקולים בסיסיים להקמת מבחני מיקרופלואידיקה חד-אקטיים במעבדה. ניתן להכין מראש כיסויים ותאי מיקרופלואידיקה (תוך חצי יום), והניסוי עצמו, שבו ניתן לבחון מספר מצבים ביוכימיים, נעשה תוך פחות מיום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

על מנת לפענח את המנגנונים המולקולריים המורכבים המווסתים את ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין, זהו נכס נהדר לניטור תגובות בודדות לחיות בתנאים מבוקרים היטב. כדי לעשות זאת, ניסויים חיים של נימה אחת הופיעו במהלך 20 השנים האחרונות, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), וסיפקו שפע של תוצאות מפתח. בשנת 2011, על מנת להרחיב עוד יותר את האפשרויות של ניסויים אלה וכדי למנוע ממצאים בעייתיים חוזרים ונשנים, הצגנו מיקרופלואידיקה פשוטה במבחנים אלה. מחקר זה מפרט את הפרוטוקול הבסיסי שלנו, שבו חוטי אקטין בודדים מעוגנים בקצה אחד למשטח הכיסוי הפסיווי, מתיישרים עם הזרימה, ויכולים להיחשף ברצף לתמיסות חלבון שונות. אנו גם מציגים את הפרוטוקולים עבור יישומים ספציפיים ומסבירים כיצד ניתן ליישם כוחות מכניים מבוקרים, הודות לגרירה הצמיגית של הפתרון הזורם. אנו מדגישים את האזהרות הטכניות של ניסויים אלה ומציגים בקצרה התפתחויות אפשריות המבוססות על טכניקה זו. פרוטוקולים והסברים אלה, יחד עם הזמינות של כיום של ציוד מיקרופלואידיקה קל לשימוש, אמורים לאפשר למי שאינם מומחים ליישם בדיקה זו במעבדותיהם.

עבור כל הניסויים שתוארו לעיל, חוטי אקטין המסומנים באופן פלואורסצנטי צריכים להיות גלויים בבירור, עם ניגודיות טובה, המעידים על פלואורסצנציה נמוכה ברקע מפני השטח (איור 4, ראו קובץ משלים 1 לפתרון בעיות נפוצות). חוטי אקטין גם לא צריכים להיצמד לפני השטח: כאשר קצב הזרימה ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

אנו משלבים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מיקרופלואידיקה כדי לחקור כיצד חלבונים קושרי אקטין מווסתים את ההרכבה, ואת הפירוק, של חוטי אקטין. באמצעות מיקרופלואידיקה, אנו מסוגלים לכמת תגובות המתרחשות על עשרות חוטי אקטין בודדים בו זמנית, תוך שליטה מדויקת בתנאים ביוכימיים ומכניים. זכור כי תמיסות מוזרקות תחילה במקביל עד שהן מגיעות לתא, ולאחר מכן, חוטים נחשפים ברצף לכל תמיסה על ידי שינוי הגדרת הלחץ.כדי להתחיל את ההכנה של polydimethylsiloxane, או PDMS, הרכבה תא, לחמם מראש את הצלחת החמה ל 100 מעלות צלזיוס. חשפו תא PDMS אחד שנוקה וכיסוי זכוכית אחד מחליק בצלחת פטרי נקייה לאור אולטרה סגול למשך שלוש עד חמש דקות בחומר ניקוי UV עמוק. בסיום, מקם את תא ה- PDMS מעל החלקת הכיסוי כך ששני המשטחים החשופים ישירות ל- UV יוכנסו במגע.כדי להסיר בועות אוויר הלכודות בממשק החלקת הכיסוי של PDMS, לחץ בעדינות על פני השטח של התא באצבע. לחצו חזק על פינות וצדדים, וודאו שתקרת החדר לא תבוא במגע עם משטח הזכוכית. הניחו את החדר עם תחתית הזכוכית הפונה לצלחת החמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן השתמשו בתא באופן מיידי, או אחסנו אותו בצלחת פטרי נקייה למשך שבוע. כדי לשטוף את צינורות הכניסה והיציאה, מלאו צינור מאגר אחד של 2 מיליליטר ב-300 מיקרוליטרים של חיץ F, הברגו אותו על מחזיק המיקרופלואידים והגדירו את הלחץ ל-300 מיליברס. תן חמש עד שמונה טיפות של F-buffer ללכת לבזבוז, ולאחר מכן להגדיר את הלחץ לאפס ולחזור על ההליך עבור כל ערוץ.לאחר מכן, הגדר את הלחץ ליציאה בצינור המאגר ארבעה עד 50 מיליברס, ברגע שיוצאת טיפה מקצה הצינורות, חבר את הצינורות לשקע של תא PDMS. כאשר הנוזל ממלא את התא ויוצא מכל הכניסות, הגדר את לחץ היציאה ל -20 מיליברס. מאוחר יותר, הגדר את הלחץ עבור צינור המאגר ל 1 עד 50 millibars.כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר, ודאו שהטיפה יוצאת מהצינורות ומכניסת ה-PDMS לפני שאתם מחברים את הצינורות לכניסה. הגדר את הלחץ של המפרצון ל 30 millibars. לאחר חיבור המפרצים שניים ושלושה כפי שהודגם, הורידו את הלחץ של כל הכניסות ל-20 מיליברס, ואת לחץ היציאה לאפס מיליברים.ודא שקצבי הזרימה בכניסות שווים בערך. בעת שינוי המאגר, הגדר את כל לחצי הכניסה ל -12 מיליברס ולחץ היציאה ל -5 מיליברס. כדי להזריק במהירות תמיסה, הגדר את הלחץ של הכניסה המתאימה ל-150 מיליברס, והתאם את הלחץ בכניסות האחרות לכ-100 מיליברס, כך שקצב הזרימה המתקבל בכניסות הוא 500 ננוליטרים לדקה.כדי לשנות את הפתרון, מלאו 200 עד 300 מיקרוליטרים של התמיסה בצינור מאגר חדש והגדירו את הלחץ להגדרת השינוי. לאחר מכן, פתח את צינור המאגר של המפרצון. לאחר שנוצרה טיפה קטנה בקצה הצינור, הברג את הצינור החדש עם הפתרון הטרי, שנה את הגדרת הלחץ לזרימה גבוהה.בהתאם לתצורה המיקרופלואידית ולגיאומטריה של התא, המתן שלוש עד חמש דקות עד שהתמיסה תמלא את הצינורות ותגיע לתא. ניתן לעקוב אחר התהליך על ידי מדידת העלייה בפלואורסצנציה לאורך זמן. לצורך פונקציונליזציה של פני השטח, החליפו את התמיסה 3 עד 200 מיקרוליטרים של 50 זרעי ספקטרין-אקטין פיקומולריים ב-F-buffer, והזיקו את התמיסה למשך שתי דקות עם זרימה גבוהה שלוש.עבור מעבר פני השטח, החלף צינור שלוש עם 300 מיקרוליטרים של 5% BSA ב- F-buffer, ולאחר מכן, הזריק במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש, ואחריו חמש דקות באמצע זרימה שלוש, עם לחץ מופחת של שבעה עד שמונה מיליברס בתעלות אחת ושתיים כדי לקבל זרימה נגדית של 100 ננוליטרים לדקה. כל משטח התא יהיה BSA passivated. החלף את הצינור שלוש ל- F-buffer כדי לשטוף את התעלה במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש.מאוחר יותר, החליפו את הצינורות אחד לשלושה עם פרופילין אקטין מיקרומולרי אחד, אקטין מיקרומולרי 0.15 ומאגר F, בהתאמה, כפי שמוסבר בכתב היד, והזריקו תמיסות מוכנות טריות באמצעות הזרימה הגבוהה, כולן מוגדרות מראש במשך שלוש עד ארבע דקות. הפעילו את המיקרוסקופ והתאימו את זמן החשיפה של המצלמה ל-100 עד 200 אלפיות השנייה, לייזר עירור ל-10 עד 20% הספק, וסך הכל פלואורסצנציה פנימית של השתקפות פנימית, או עומק TIRF, ב-200 עד 300 ננומטר כדי לצלם את התמונות עם מטרה של פי 60. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הלחץ לאמצע זרימה אחת למשך 10 דקות כדי לרשום את פילמור החוטים בקצב של מסגרת אחת כל 20 שניות, ולאחר מכן את זרימת הביניים שתיים למשך 15 דקות להזדקנות נימה.לכידת דה-פולימריזציה במצב אפיפלואורסצנציה בפריים אחד כל חמש שניות, לאחר פעימה אחת עד שתיים, עבור לזרימה האמצעית שלוש כדי לרשום נימים מתפרקים בסביבות 10 תת-יחידות בשנייה. כדי לאפס את הניסוי, שברו את כל החוטים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי חשיפה רציפה שלהם ללייזר בעוצמה מקסימלית למשך שתי דקות. בדקו תנאים שונים על ידי שינוי תמיסות אחת, שתיים או שלוש והזרקתן בזרימה גבוהה במשך שלוש עד ארבע דקות.התוצאה של ניסוי הפילמור/דה-פולימריזציה הבסיסי מוצגת כאן. הקימוגרפים שהתקבלו שימשו לכימות שיעורי הפילמור והדה-פולימריזציה. כאשר חוטי האקטין הגדלים נחשפו לתמיסת קופילין המסומנת באופן פלואורסצנטי, צבירי הקופילין נוקו וצמחו לעבר הקצוות המחודדים והתוחמים.כאשר חוטים בודדים נחשפים לקסין הם יוצרים צרורות שנראים בהירים יותר ולא מיושרים בצורה מושלמת עם הזרימה. חשוב מאוד להימנע מהכנסת בועות אוויר במערכת בעת החלפת צינורות ולשים לב לא לקבל צינורות מאגר ריקים. טכניקה זו הייתה קריטית להפעלת כוחות משיכה על פני עשרות חוטים בודדים, התבוננות ברגישות מכנית של פורמין וקופילין, והתפרקות ARP2/3.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...