Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
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हम बी लाडौक्स और आर-एम के आभारी हैं। उनके यूवी-क्लीनर उपकरणों के उपयोग के लिए मेज प्रयोगशाला, और जे। प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए हम सिलिकॉन वेफर्स पर मोल्ड तैयार करने और माइक्रोफ्लुइडिक्स पर सुझाव प्रदान करने पर प्राप्त हुए। हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद ग्रांट एसटीजी -679116 (एजे के लिए) और एजेंस नेशनेल डी ला रेचेर्चे अनुदान मस्कैक्टिन और कंफॉर्मिन (जीआर-एल के लिए) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।

1. माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर की तैयारी
<ol><li>कई कक्ष पैटर्न के साथ एक एसयू -8 मास्टर मोल्ड का चयन करें। विशिष्ट कक्षों तीन इनलेट्स और एक आउटलेट, 20 μm उच्च और 800 μm चौड़ा (चित्रा 1) के साथ पार आकार के ह...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

मानक एकल-फिलामेंट विधियों की तुलना में जहां एक्टिन फिलामेंट्स को उनकी लंबाई के साथ कई बिंदुओं द्वारा सतह पर लंगर डाला जाता है या मिथाइलसेल्यूलोज जैसे भीड़ एजेंट द्वारा इसके करीब बनाए रखा जाता है, माइक...

एक्टिन फिलामेंट्स और एक्टिन फिलामेंट नेटवर्क की असेंबली और विघटन को कई जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है और यांत्रिक संदर्भ पर निर्भर करता है। इन जटिल तंत्रों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, व्यक्तिगत फिलामेंट्स (पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में) पर व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने में सक्षम होना अमूल्य है। पिछले दशकों में, वास्तविक समय में गतिशील एक्टिन फिलामेंट्स का अवलोकन, ज्यादातर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, एक प्रमुख तकनीक के रूप में उभरा है और परिणामों की एक प्रभावशाली सूची प्रदान की है जो थोक समाधान जैव रासायनिक परख1 के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता था।
इसे प्राप्त करने के लिए, किसी को एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) के समाधान के लिए उजागर करते हुए माइक्रोस्कोप कवरस्लिप की सतह के करीब फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एक्टिन फिलामेंट्स को बनाए रखने की आवश्यकता होती है, जिसे फ्लोरोसेंटली लेबल भी किया जा सकता है। ऐसा करने से अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक स्थितियों में व्यक्तिगत फिलामेंट्स पर होने वाली घटनाओं की निगरानी करने का एक साधन प्रदान करता है, और इस प्रकार प्रतिक्रिया दरों को निर्धारित करता है। हालांकि, कई विशिष्ट सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। कृत्रिम रूप से सतह के करीब फिलामेंट्स को बनाए रखना, अक्सर कई एंकरिंग बिंदुओं के लिए धन्यवाद या मिथाइलसेल्यूलोज जैसे भीड़ एजेंट का उपयोग करके, उनके व्यवहार को बदल सकता है (उदाहरण के लिए, उनके पोलीमराइजेशन और डिपोलिमराइजेशन2 में विराम पैदा करना)। प्रत्येक फिलामेंट के समोच्च को ट्रैक करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर अगर समय के साथ देखने के क्षेत्र में नए फिलामेंट्स या फिलामेंट टुकड़े जमा होते हैं। प्रतिक्रियाएं एक परिमित मात्रा में होती हैं जहां एक्टिन मोनोमर्स और एबीपी की एकाग्रता समय के साथ भिन्न हो सकती है, जिससे संभावित रूप से सटीक दर स्थिरांक प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। अंत में, एबीपी के समाधान को नवीनीकृत या बदलना 30 एस से कम समय में प्राप्त करना मुश्किल है और अक्सर नमूने में असजातीय प्रोटीन सामग्री का कारण होगा।
10 साल पहले, व्यक्तिगत डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) किस्में3 का अध्ययन करने के लिए पहले से ही क्या किया गया था, इससे प्रेरित होकर, हमने व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स 4 का निरीक्षण और हेरफेर करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स के आधार पर एक नई तकनीक पेशकी। यह शास्त्रीय एकल-फिलामेंट तकनीकों की उपरोक्त सीमाओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है। इन माइक्रोफ्लुइडिक्स परखों में, एक्टिन फिलामेंट्स को कवरस्लिप पर अधिशोषित स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीजों से उगाया जाता है। फिलामेंट्स इस प्रकार केवल माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के नीचे एक छोर से लंगर डाले जाते हैं और चिपके बिना सतह के ऊपर उतार-चढ़ाव करते हैं। फिलामेंट्स आने वाले समाधानों के प्रवाह के साथ संरेखित होते हैं, जिससे उनकी समोच्च लंबाई की निगरानी आसान हो जाती है और उन्हें कवरस्लिप के ऊपर एक उथले क्षेत्र में बनाए रखा जाता है जहां टीआईआरएफ का उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न समाधानों को मिश्रण के बिना एक साथ कक्ष में प्रवाहित किया जाता है, और फिलामेंट्स को क्रमिक रूप से और तेजी से उनके संपर्क में लाया जा सकता है।
यहां, हम प्रयोगशाला में एकल-एक्टिन-फिलामेंट माइक्रोफ्लुइडिक्स परख स्थापित करने के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का प्रस्ताव करते हैं। कवरलिप्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स कक्षों को पहले से (आधे दिन में) तैयार किया जा सकता है, और प्रयोग ही, जहां कई जैव रासायनिक स्थितियों का परीक्षण किया जा सकता है, एक दिन से भी कम समय में किया जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

जटिल आणविक तंत्र को समझने के लिए जो एक्टिन फिलामेंट्स की असेंबली और विघटन को विनियमित करते हैं, यह अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में रहने वाली व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए एक महान संपत्ति है। ऐसा करने के लिए, पिछले 20 वर्षों में लाइव सिंगल-फिलामेंट प्रयोग उभरे हैं, ज्यादातर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, और प्रमुख परिणामों का एक ट्रोव प्रदान किया है। 2011 में, इन प्रयोगों की संभावनाओं को और बढ़ाने और आवर्ती समस्याग्रस्त कलाकृतियों से बचने के लिए, हमने इन परखों में सरल माइक्रोफ्लुइडिक्स पेश किए। यह अध्ययन हमारे मूल प्रोटोकॉल का विवरण देता है, जहां व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स निष्क्रिय कवरस्लिप सतह पर एक छोर से लंगर डाले जाते हैं, प्रवाह के साथ संरेखित होते हैं, और क्रमिक रूप से विभिन्न प्रोटीन समाधानों के संपर्क में आ सकते हैं। हम विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं और बताते हैं कि नियंत्रित यांत्रिक बलों को कैसे लागू किया जा सकता है, बहने वाले समाधान के चिपचिपा खींचें के लिए धन्यवाद। हम इन प्रयोगों की तकनीकी चेतावनियों को उजागर करते हैं और संक्षेप में इस तकनीक के आधार पर संभावित विकास प्रस्तुत करते हैं। इन प्रोटोकॉल और स्पष्टीकरण, उपयोग में आसान माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरणों की आज की उपलब्धता के साथ, गैर-विशेषज्ञों को अपनी प्रयोगशालाओं में इस परख को लागू करने की अनुमति देनी चाहिए।

ऊपर वर्णित सभी प्रयोगों के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन फिलामेंट्स स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए, अच्छे विपरीत के साथ, सतह से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का संकेत (चित्रा 4, सामान्य मुद्दों क...

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Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में सरल एक्टिन फिलामेंट माइक्रोफ्लुइडिक परख के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो किसी को वास्तविक समय में व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स की सटीक निगरानी करने की अनुमति देता है, जबकि क्रमिक रूप से उन्हें विभिन्न प्रोटीन समाधानों के संपर्क में लाता है।

एकल एक्टिन फिलामेंट्स और बंडलों की असेंबली गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

हम माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को जोड़ते हैं ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन एक्टिन फिलामेंट्स की असेंबली और विघटन को कैसे विनियमित करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ, हम जैव रासायनिक और यांत्रिक स्थितियों को ठीक से नियंत्रित करते हुए एक साथ दसियों व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स पर होने वाली प्रतिक्रियाओं को मापने में सक्षम हैं। याद रखें कि समाधान पहले समानांतर में इंजेक्ट किए जाते हैं जब तक कि वे कक्ष तक नहीं पहुंच जाते हैं, और फिर, फिलामेंट्स को दबाव सेटिंग को बदलकर प्रत्येक समाधान के लिए क्रमिक रूप से उजागर किया जाता है।पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन, या पीडीएमएस, चैंबर असेंबली की तैयारी शुरू करने के लिए, गर्म प्लेट को 100 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें। एक साफ पीडीएमएस चैंबर और एक गिलास कवर पर्ची को एक गहरे यूवी क्लीनर में तीन से पांच मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश में एक साफ पेट्री डिश में उजागर करें। जब किया जाता है, तो कवर स्लिप पर पीडीएमएस कक्ष की स्थिति जैसे कि यूवी के संपर्क में सीधे दो सतहों को संपर्क में रखा जाता है।पीडीएमएस कवर पर्ची इंटरफ़ेस पर फंसे हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, धीरे से एक उंगली के साथ कक्ष की सतह दबाएं। कोनों और पक्षों पर दृढ़ता से दबाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि कक्ष की छत कांच की सतह के संपर्क में नहीं आती है। पांच मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट का सामना करने वाले ग्लास तल के साथ कक्ष रखें।फिर कक्ष का तुरंत उपयोग करें, या इसे एक सप्ताह के लिए एक साफ पेट्री डिश में स्टोर करें। इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग को कुल्ला करने के लिए, एफ-बफर के 300 माइक्रोलीटर के साथ एक 2 मिलीलीटर जलाशय ट्यूब भरें, इसे माइक्रोफ्लुइडिक धारक पर पेंच करें, और दबाव को 300 मिलीबार पर सेट करें। एफ-बफर की पांच से आठ बूंदों को बर्बाद होने दें, फिर दबाव को शून्य पर सेट करें और प्रत्येक चैनल के लिए प्रक्रिया दोहराएं।अगला, जलाशय ट्यूब चार से 50 मिलीबार पर आउटलेट के लिए दबाव सेट करें, एक बार टयूबिंग टिप से एक बूंद बाहर आने के बाद, ट्यूबिंग को पीडीएमएस चैंबर के आउटलेट से कनेक्ट करें। जैसा कि तरल कक्ष को भरता है और सभी इनलेट से बाहर आता है, आउटलेट दबाव को 20 मिलीबार पर सेट करें। बाद में, जलाशय ट्यूब के लिए दबाव 1 से 50 मिलीबार पर सेट करें।हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग को इनलेट से जोड़ने से पहले ट्यूबिंग और पीडीएमएस इनलेट से एक बूंद निकलती है। इनलेट के दबाव को 30 मिलीबार पर सेट करें। प्रदर्शन के रूप में इनलेट दो और तीन को जोड़ने के बाद, सभी इनलेट्स के दबाव को 20 मिलीबार पर सेट करें, और आउटलेट दबाव को शून्य मिलीबार पर सेट करें।सुनिश्चित करें कि इनलेट में प्रवाह दर लगभग बराबर है। जलाशय को बदलते समय, सभी इनलेट दबावों को 12 मिलीबार और आउटलेट दबाव को 5 मिलीबार पर सेट करें। एक समाधान को तेजी से इंजेक्ट करने के लिए, संबंधित इनलेट के दबाव को 150 मिलीबार पर सेट करें, और अन्य इनलेट में दबाव को लगभग 100 मिलीबार में समायोजित करें, जैसे कि इनलेट में परिणामी प्रवाह दर 500 नैनोलीटर प्रति मिनट है।समाधान को बदलने के लिए, एक नए जलाशय ट्यूब में समाधान के 200 से 300 माइक्रोलीटर भरें और परिवर्तन सेटिंग पर दबाव सेट करें। फिर, इनलेट के जलाशय ट्यूब को खोल दें। एक बार टयूबिंग टिप पर एक छोटी बूंद का गठन हो जाने के बाद, ताजा समाधान के साथ नई ट्यूब में पेंच करें, दबाव सेटिंग को उच्च प्रवाह में बदल दें।माइक्रोफ्लुइडिक कॉन्फ़िगरेशन और चैंबर ज्यामिति के आधार पर, ट्यूबिंग में भरने और कक्ष तक पहुंचने के लिए समाधान के लिए तीन से पांच मिनट तक प्रतीक्षा करें। समय के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि को मापकर प्रक्रिया का पालन किया जा सकता है। सतह कार्यात्मकता के लिए, एफ-बफर में 50 पिकोमोलर स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज के समाधान तीन से 200 माइक्रोलीटर बदलें, और उच्च प्रवाह तीन के साथ दो मिनट के लिए समाधान इंजेक्ट करें।सतह निष्क्रियता के लिए, एफ-बफर में 5% बीएसए के 300 माइक्रोलीटर के साथ ट्यूब तीन बदलें, फिर, उच्च प्रवाह तीन पर पांच मिनट के लिए इंजेक्ट करें, इसके बाद मध्य प्रवाह तीन पर पांच मिनट, चैनल एक और दो में सात से आठ मिलीबार के कम दबाव के साथ प्रति मिनट 100 नैनोलीटर का काउंटरफ्लो प्राप्त करने के लिए। पूरे कक्ष की सतह बीएसए निष्क्रिय हो जाएगी। उच्च प्रवाह तीन पर पांच मिनट के लिए चैनल कुल्ला करने के लिए एफ बफर करने के लिए ट्यूब तीन बदलें।बाद में, एक माइक्रोमोलर एक्टिन प्रोफिलिन, 0.15 माइक्रोमोलर एक्टिन और एफ बफर के साथ ट्यूबों को क्रमशः एक से तीन में बदलें, जैसा कि पांडुलिपि में समझाया गया है, और तीन से चार मिनट के लिए सभी पूर्व निर्धारित उच्च प्रवाह का उपयोग करके ताजा तैयार समाधान इंजेक्ट करें। माइक्रोस्कोप पर स्विच करें और 60 एक्स उद्देश्य के साथ छवियों को कैप्चर करने के लिए 200 से 300 नैनोमीटर पर 100 से 200 मिलीसेकंड, उत्तेजना लेजर से 10 से 200% पावर, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति, या टीआईआरएफ गहराई को समायोजित करें। अगला, हर 20 सेकंड में एक फ्रेम की दर से फिलामेंट पोलीमराइजेशन रिकॉर्ड करने के लिए 10 मिनट के लिए दबाव सेटिंग को मध्य प्रवाह पर सेट करें, इसके बाद फिलामेंट उम्र बढ़ने के लिए 15 मिनट के लिए मध्य प्रवाह दो।हर पांच सेकंड में एक फ्रेम पर एपिफ्लोरेसेंस मोड में डिपोलिमराइजेशन कैप्चर करें, एक से दो फ्रेम के बाद, प्रति सेकंड लगभग 10 सबयूनिट्स पर फिलामेंट्स को रिकॉर्ड करने के लिए मध्य प्रवाह तीन पर स्विच करें। प्रयोग को रीसेट करने के लिए, दो मिनट के लिए अधिकतम शक्ति पर लेजर को लगातार उजागर करके सभी फ्लोरोसेंटली लेबल फिलामेंट्स को तोड़ दें। समाधान एक, दो, या तीन को बदलकर और उन्हें तीन से चार मिनट के लिए उच्च प्रवाह पर इंजेक्ट करके विभिन्न स्थितियों का परीक्षण करें।डिपोलिमराइजेशन प्रयोग का परिणाम यहां प्रस्तुत किया गया है। परिणामी काइमोग्राफ का उपयोग पोलीमराइजेशन और डिपोलिमराइजेशन दरों को मापने के लिए किया गया था। जब उगाए गए एक्टिन फिलामेंट्स को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोफिलिन समाधान के संपर्क में लाया गया था, तो कोफिलिन क्लस्टर को न्यूक्लिएट किया गया था और नुकीले और कांटेदार सिरों की ओर बढ़ाया गया था।जब एकल फिलामेंट्स फासीन के संपर्क में आते हैं तो वे बंडल बनाते हैं जो उज्ज्वल दिखाई देते हैं और प्रवाह के साथ पूरी तरह से संरेखित नहीं होते हैं। ट्यूबों को बदलते समय सिस्टम में हवा के बुलबुले पेश करने से बचना और जलाशय ट्यूबों को खाली न करने पर ध्यान देना बहुत महत्वपूर्ण है। यह तकनीक दसियों एकल फिलामेंट्स पर खींचने वाले बलों को लागू करने, फॉर्मिन और कोफिलिन यांत्रिक संवेदनशीलता और एआरपी 2/3 डीब्रांचिंग को देखने के लिए महत्वपूर्ण थी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

संरचना और Nucleosomes की गतिशीलता परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग कर की जांच

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ पोडोसाइटिक प्रोटीन नेफ्रिन, ऐक्टिन और पोडोसिन की इमेजिंग

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...