Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
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Siamo grati a B. Ladoux e R.-M. Laboratorio Mège per l'uso delle loro apparecchiature di pulizia UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure per la formazione iniziale che abbiamo ricevuto sulla preparazione di stampi su wafer di silicio e fornendo suggerimenti sulla microfluidica. Riconosciamo i finanziamenti della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca StG-679116 (ad A.J.) e delle sovvenzioni agence Nationale de la Recherche Muscactin e Conformin (a G.R.-L.).

1. Preparazione della camera microfluidica
<ol><li>Selezionate uno stampo master SU-8 con diversi modelli di camera. Le camere tipiche sono a forma di croce con tre ingressi e un'uscita, 20 μm di altezza e 800 μm di larghezza (Figura 1). Tali stampi master possono essere acquistati da aziende esterne o realizzati in laboratori accademici (ad esempio, Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Posizionare il nastro attorno al bordo dello stampo.<ol>
<li>Metti...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Rispetto ai metodi standard a filamento singolo in cui i filamenti di actina sono ancorati alla superficie da più punti lungo la loro lunghezza o mantenuti vicino ad essa da un agente di affollamento come la metilcellulosa, la microfluidica offre una serie di vantaggi. Poiché le interazioni con la superficie sono minime, vengono evitate le pause artificiali che queste interazioni possono indurre sia durante l'allungamento che durante la depolimerizzazione. I filamenti sono allineati dal flusso, paralleli tra loro, faci...

L'assemblaggio e lo smontaggio di filamenti di actina e reti di filamenti di actina sono controllati da diverse reazioni biochimiche e dipendono dal contesto meccanico. Al fine di ottenere informazioni su questi complessi meccanismi, è inestimabile essere in grado di osservare le singole reazioni sui singoli filamenti (in numero sufficientemente grande). Negli ultimi decenni, l'osservazione di filamenti dinamici di actina in tempo reale, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), è emersa come una tecnica chiave e ha fornito un elenco impressionante di risultati che non avrebbero potuto essere ottenuti con i saggi biochimici di soluzione di massa1.
Per raggiungere questo obiettivo, è necessario mantenere filamenti di actina marcati fluorescentemente vicino alla superficie del coverslip del microscopio mentre li si espone a soluzioni di proteine leganti l'actina (ABP), che possono anche essere etichettate fluorescentemente. Ciò fornisce un mezzo per monitorare gli eventi che si verificano su singoli filamenti in condizioni biochimiche ben controllate e quindi quantificare le velocità di reazione. Tuttavia, dovrebbero essere prese in considerazione una serie di limitazioni specifiche. Mantenere artificialmente i filamenti vicini alla superficie, spesso grazie a più punti di ancoraggio o utilizzando un agente di affollamento come la metilcellulosa, può alterare il loro comportamento (ad esempio, causando pause nella loro polimerizzazione e depolimerizzazione2). Tracciare il contorno di ciascun filamento può essere difficile, in particolare se nuovi filamenti o frammenti di filamento si accumulano nel campo visivo nel tempo. Le reazioni avvengono in un volume finito in cui la concentrazione di monomeri di actina e ABP può variare nel tempo, rendendo potenzialmente difficile ricavare costanti di velocità accurate. Infine, rinnovare o modificare la soluzione di ABP è difficile da ottenere in meno di 30 s e spesso porterà a un contenuto proteico disomogeneo nel campione.
Poco più di 10 anni fa, ispirati da quanto già fatto per studiare i singoli filamenti di Acido Desossiribonucleico (DNA)3, abbiamo introdotto una nuova tecnica basata sulla microfluidica per osservare e manipolare i singoli filamenti di actina4. Permette di aggirare le suddette limitazioni delle tecniche classiche a singolo filamento. In questi saggi di microfluidica, i filamenti di actina vengono coltivati da semi di spettrina-actina adsorbiti sul coperchio. I filamenti sono quindi ancorati da un'estremità solo al fondo della camera microfluidica e fluttuano sopra la superficie senza attaccarsi. I filamenti si allineano con il flusso delle soluzioni in entrata, facilitando così il monitoraggio della loro lunghezza del contorno e mantenendoli in una regione poco profonda sopra il coperchio in cui è possibile utilizzare TIRF. Diverse soluzioni vengono simultaneamente fatte fluire nella camera senza miscelazione e i filamenti possono essere esposti a loro in sequenza e rapidamente.
Qui, proponiamo una serie di protocolli di base per impostare saggi di microfluidica a filamento singolo di actina in laboratorio. Coverslips e camere microfluidiche possono essere preparati in anticipo (in mezza giornata) e l'esperimento stesso, in cui è possibile testare diverse condizioni biochimiche, viene eseguito in meno di un giorno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

Al fine di decifrare i complessi meccanismi molecolari che regolano l'assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina, è una grande risorsa monitorare le singole reazioni dal vivo in condizioni ben controllate. Per fare ciò, negli ultimi 20 anni sono emersi esperimenti dal vivo a singolo filamento, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e hanno fornito una miniera di risultati chiave. Nel 2011, al fine di espandere ulteriormente le possibilità di questi esperimenti ed evitare artefatti problematici ricorrenti, abbiamo introdotto semplici microfluidiche in questi test. Questo studio descrive in dettaglio il nostro protocollo di base, in cui i singoli filamenti di actina sono ancorati da un'estremità alla superficie passivata del coverslip, si allineano con il flusso e possono essere successivamente esposti a diverse soluzioni proteiche. Presentiamo anche i protocolli per applicazioni specifiche e spieghiamo come possono essere applicate forze meccaniche controllate, grazie alla resistenza viscosa della soluzione scorrevole. Evidenziamo gli avvertimenti tecnici di questi esperimenti e presentiamo brevemente i possibili sviluppi basati su questa tecnica. Questi protocolli e spiegazioni, insieme alla disponibilità odierna di apparecchiature di microfluidica facili da usare, dovrebbero consentire ai non specialisti di implementare questo test nei loro laboratori.

Per tutti gli esperimenti sopra descritti, i filamenti di actina marcati fluorescentemente dovrebbero essere chiaramente visibili, con un buon contrasto, indicativo di una bassa fluorescenza di fondo dalla superficie (Figura 4, vedere il file supplementare 1 per la risoluzione dei problemi comuni). Anche i filamenti di actina non dovrebbero attaccarsi alla superficie: quando la portata dominante è bassa, le fluttuazioni laterali dei filamenti di actina dovrebbero essere per...

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Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Combiniamo la microscopia a fluorescenza con la microfluidica per studiare come le proteine leganti l'actina regolano l'assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina. Con la microfluidica, siamo in grado di quantificare le reazioni che si verificano su decine di singoli filamenti di actina contemporaneamente, controllando con precisione le condizioni biochimiche e meccaniche. Ricorda che le soluzioni vengono prima iniettate in parallelo fino a raggiungere la camera, quindi i filamenti vengono esposti in sequenza a ciascuna soluzione modificando l'impostazione della pressione.Per iniziare la preparazione del polidimetilsilossano, o PDMS, assemblaggio della camera, preriscaldare la piastra calda a 100 gradi Celsius. Esporre una camera PDMS pulita e un coperchio di vetro scivolare in una capsula di Petri pulita alla luce ultravioletta per tre-cinque minuti in un detergente UV profondo. Al termine, posizionare la camera PDMS sopra lo slittamento del coperchio in modo tale che le due superfici direttamente esposte ai raggi UV siano messe a contatto.Per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nell'interfaccia di scorrimento del coperchio PDMS, premere delicatamente la superficie della camera con un dito. Premere con forza su angoli e lati, assicurandosi che il soffitto della camera non entri in contatto con la superficie del vetro. Posizionare la camera con il fondo di vetro rivolto verso la piastra calda a 100 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi utilizzare immediatamente la camera o conservarla in una capsula di Petri pulita per una settimana. Per risciacquare il tubo di ingresso e di uscita, riempire un tubo del serbatoio da 2 millilitri con 300 microlitri di F-buffer, avvitarlo sul supporto microfluidico e impostare la pressione su 300 millibar. Lasciare che da cinque a otto gocce di F-buffer vadano sprecate, quindi impostare la pressione a zero e ripetere la procedura per ciascun canale.Quindi, impostare la pressione per l'uscita sul tubo del serbatoio da quattro a 50 millibar, una volta che una goccia esce dalla punta del tubo, collegare il tubo all'uscita della camera PDMS. Quando il liquido riempie la camera ed esce da tutte le entrate, impostare la pressione di uscita a 20 millibar. Successivamente, impostare la pressione per il tubo del serbatoio da 1 a 50 millibar.Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, assicurarsi che una goccia esca dal tubo e dall'ingresso PDMS prima di collegare il tubo a quello in ingresso. Impostare la pressione dell'ingresso su 30 millibar. Dopo aver collegato le prese due e tre come dimostrato, impostare la pressione di tutte le prese a 20 millibar e la pressione di uscita a zero millibar.Assicurarsi che le portate nelle prese siano approssimativamente uguali. Quando si cambia il serbatoio, impostare tutte le pressioni di ingresso su 12 millibar e la pressione di uscita su 5 millibar. Per iniettare rapidamente una soluzione, impostare la pressione dell'ingresso corrispondente a 150 millibar e regolare la pressione negli altri ingressi a circa 100 millibar, in modo tale che la portata risultante nelle prese sia di 500 nanolitri al minuto.Per cambiare la soluzione, riempire da 200 a 300 microlitri della soluzione in un nuovo tubo del serbatoio e impostare la pressione sull'impostazione di modifica. Quindi, svitare il tubo del serbatoio dell'ingresso. Una volta che una piccola goccia si è formata sulla punta del tubo, avvitare il nuovo tubo con la soluzione fresca, modificare l'impostazione della pressione su un flusso elevato.A seconda della configurazione microfluidica e della geometria della camera, attendere da tre a cinque minuti affinché la soluzione riempia il tubo e raggiunga la camera. Il processo può essere seguito misurando l'aumento della fluorescenza nel tempo. Per la funzionalizzazione superficiale, cambiare la soluzione da tre a 200 microlitri di 50 semi di spettrina-actina picomolare in F-buffer e iniettare la soluzione per due minuti con un flusso tre elevato.Per la passivazione superficiale, cambiare il tubo tre con 300 microlitri del 5% BSA in F-buffer, quindi, iniettare per cinque minuti ad alto flusso tre, seguito da cinque minuti a metà flusso tre, con pressione ridotta da sette a otto millibar nei canali uno e due per ottenere un controflusso di 100 nanolitri al minuto. L'intera superficie della camera sarà passivata BSA. Cambiare il tubo tre in F-buffer per risciacquare il canale per cinque minuti ad alto flusso tre.Successivamente, cambiare i tubi da uno a tre con un'actina profilina micromolare, 0,15 actina micromolare e tampone F, rispettivamente, come spiegato nel manoscritto, e iniettare soluzioni appena preparate usando l'alto flusso tutto preimpostato per tre o quattro minuti. Accendere il microscopio e regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 100-200 millisecondi, il laser di eccitazione al 10-20% di potenza e la fluorescenza totale della riflessione interna, o profondità TIRF, da 200 a 300 nanometri per acquisire le immagini con un obiettivo 60X. Quindi, impostare l'impostazione della pressione a metà flusso uno per 10 minuti per registrare la polimerizzazione del filamento alla velocità di un fotogramma ogni 20 secondi, seguita da un flusso medio due per 15 minuti per l'invecchiamento del filamento.Cattura la depolimerizzazione in modalità epifluorescenza a un fotogramma ogni cinque secondi, dopo uno o due fotogrammi, passa a un flusso medio tre per registrare i filamenti depolimerizzanti a circa 10 subunità al secondo. Per ripristinare l'esperimento, rompere tutti i filamenti etichettati in modo fluorescente esponendoli continuamente al laser alla massima potenza per due minuti. Testare condizioni diverse cambiando le soluzioni uno, due o tre e iniettandole ad alto flusso per tre o quattro minuti.Il risultato dell'esperimento di polimerizzazione/ depolimerizzazione di base è presentato qui. I kymografi risultanti sono stati utilizzati per quantificare i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione. Quando i filamenti di actina cresciuti sono stati esposti a una soluzione di cofilina marcata fluorescentemente, i grappoli di cofilina sono stati nucleati e cresciuti verso le estremità appuntite e spinate.Quando i singoli filamenti sono esposti al fascio formano fasci che appaiono più luminosi e non perfettamente allineati con il flusso. È molto importante evitare di introdurre bolle d'aria nel sistema quando si cambiano i tubi e prestare attenzione a non svuotare i tubi del serbatoio. Questa tecnica è stata fondamentale per applicare forze di trazione su decine di singoli filamenti, esaminare la sensibilità meccanica di formina e cofilina e il debranching ARP2/3.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

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