Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Vi er takknemlige for B. Ladoux og R.-M. Mège lab for bruk av UV-renere utstyr, og J. Heuvingh og 0. du Roure for den første opplæringen vi fikk om å forberede former på silisiumskiver og gi tips om mikrofluidikk. Vi anerkjenner finansiering fra European Research Council Grant StG-679116 (til A.J.) og Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (til G.R.-L.).

1. Mikrofluidisk kammerpreparat
<ol><li>Velg en SU-8 master mold med flere kammermønstre. Typiske kamre er kryssformede med tre viker og ett uttak, 20 μm høyt og 800 μm bredt (figur 1). Slike masterformer kan kjøpes fra eksterne selskaper eller gjøres i akademiske laboratorier (f.eks. Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Plasser tape rundt kanten av formen.<ol>
<li>Sett ~50 cm lang, 19 mm bred, standard gjennomsiktig kontortape (se Material...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder der aktinfilamenter er forankret til overflaten med flere punkter langs lengden eller opprettholdt nær den av et trengselmiddel som metylcellulose, gir mikrofluidikk en rekke fordeler. Siden interaksjoner med overflaten er minimale, unngås de kunstige pausene disse interaksjonene kan indusere under både forlengelse og depolymerisering. Filamentene er justert av strømmen, parallelt med hverandre, letter overvåkingen og målingen av lengdene. Løsningen rundt filamentene...

Montering og demontering av aktinfilamenter og aktinfilamentnettverk styres av flere biokjemiske reaksjoner og avhenger av den mekaniske konteksten. For å få innsikt i disse komplekse mekanismene er det uvurderlig å kunne observere individuelle reaksjoner på individuelle filamenter (i tilstrekkelig store antall). I løpet av de siste tiårene har observasjonen av dynamiske aktinfilamenter i sanntid, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, dukket opp som en nøkkelteknikk og har gitt en imponerende liste over resultater som ikke kunne ha blitt oppnådd med bulkløsning biokjemiske analyser1.
For å oppnå dette må man opprettholde fluorescerende merkede aktinfilamenter nær overflaten av mikroskopdekslene mens man utsetter dem for løsninger av aktinbindende proteiner (ABPer), som også kan merkes fluorescerende. Dette gir et middel til å overvåke hendelser som finner sted på individuelle filamenter under godt kontrollerte biokjemiske forhold, og dermed kvantifisere reaksjonshastigheter. En rekke spesifikke begrensninger bør imidlertid vurderes. Kunstig vedlikehold av filamenter nær overflaten, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved å bruke et trengselmiddel som metylcellulose, kan endre deres oppførsel (f.eks. forårsaker pauser i polymerisasjonen og depolymerisering2). Det kan være utfordrende å spore konturen til hver filament, spesielt hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres innen synsfeltet over tid. Reaksjonene skjer i et begrenset volum der konsentrasjonen av aktinmonomerer og ABPer kan variere over tid, noe som potensielt gjør det vanskelig å utlede nøyaktige hastighetskonstanter. Endelig er det vanskelig å fornye eller endre løsningen av ABPer på mindre enn 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteininnhold i prøven.
For litt over 10 år siden, inspirert av det som allerede var gjort for å studere individuelle Deoxyribonucleic Acid (DNA) tråder3, introduserte vi en ny teknikk basert på mikrofluidikk for å observere og manipulere individuelle aktinfilamenter4. Det gjør det mulig å omgå de nevnte begrensningene i klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidikkanalysene dyrkes aktinfilamenter fra spektrrin-aktinfrø adsorbert på dekslene. Filamenter er dermed forankret i den ene enden bare til bunnen av mikrofluidisk kammer og svinger over overflaten uten å stikke. Filamenter samsvarer med strømmen av innkommende løsninger, og letter dermed overvåkingen av konturlengden og opprettholder dem i et grunt område over dekslene der TIRF kan brukes. Ulike løsninger strømmes samtidig inn i kammeret uten blanding, og filamentene kan eksponeres for dem sekvensielt og raskt.
Her foreslår vi en rekke grunnleggende protokoller for å sette opp mikrofluidikkanalyser i laboratoriet. Deksler og mikrofluidikkkamre kan tilberedes på forhånd (på en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokjemiske forhold kan testes, gjøres på mindre enn en dag.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

For å dechiffrere de komplekse molekylære mekanismene som regulerer montering og demontering av aktinfilamenter, er det en stor ressurs å overvåke individuelle reaksjoner lever i godt kontrollerte forhold. For å gjøre det har levende enkeltfilamenteksperimenter dukket opp de siste 20 årene, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, og har gitt en trove av viktige resultater. I 2011, for å ytterligere utvide mulighetene for disse eksperimentene og for å unngå tilbakevendende problematiske artefakter, introduserte vi enkel mikrofluidikk i disse analysene. Denne studien beskriver vår grunnleggende protokoll, der individuelle aktinfilamenter er forankret i den ene enden til den passiverte coverlipoverflaten, samsvarer med strømmen, og kan etterfølgende eksponeres for forskjellige proteinløsninger. Vi presenterer også protokollene for spesifikke applikasjoner og forklarer hvordan kontrollerte mekaniske krefter kan brukes, takket være den viskøse dra av den flytende løsningen. Vi fremhever de tekniske forbeholdene til disse eksperimentene og presenterer kort mulige utviklinger basert på denne teknikken. Disse protokollene og forklaringene, sammen med dagens tilgjengelighet av brukervennlig mikrofluidikkutstyr, bør tillate ikke-spesialister å implementere denne analysen i laboratoriene sine.

For alle forsøkene beskrevet ovenfor, bør fluorescerende merket aktinfilamenter være tydelig synlige, med god kontrast, som indikerer lav bakgrunnsfluorescens fra overflaten (figur 4, se Tilleggsfil 1 for feilsøking av vanlige problemer). Actin filaments bør heller ikke holde seg til overflaten: Når den dominerende strømningshastigheten er lav, bør aktinfilamentenes laterale svingninger være merkbare når man observerer dem levende og la en tydelig bestemme at de ba...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Vi presenterer protokoller for enkle aktinfilamentmikrofluidiske analyser, i kombinasjon med fluorescensmikroskopi, som gjør det mulig for en å nøyaktig overvåke individuelle aktinfilamenter i sanntid mens man sekvensielt utsetter dem for forskjellige proteinløsninger.

Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Vi kombinerer fluorescensmikroskopi med mikrofluidikk for å studere hvordan aktinbindende proteiner regulerer monteringen, og demonteringen, av aktinfilamenter. Med mikrofluidikk er vi i stand til å kvantifisere reaksjoner som skjer på titalls individuelle aktinfilamenter samtidig, samtidig som vi nøyaktig kontrollerer biokjemiske og mekaniske forhold. Husk at løsninger først injiseres parallelt til de når kammeret, og deretter blir filamenter eksponert sekvensielt for hver løsning ved å endre trykkinnstillingen.For å starte forberedelsen av polydimetylsiloksan, eller PDMS, kammermontering, forvarm varmeplaten til 100 grader Celsius. Eksponer ett renset PDMS-kammer og ett glassdeksel i en ren Petri-tallerken for ultrafiolett lys i tre til fem minutter i et dypt UV-rengjøringsmiddel. Når du er ferdig, plasserer du PDMS-kammeret over dekselslippet slik at de to overflatene som er direkte eksponert for UV, settes i kontakt.Hvis du vil fjerne luftbobler som sitter fast ved skligrensesnittet til PDMS-dekselet, trykker du forsiktig på overflaten av kammeret med en finger. Trykk sterkt over hjørner og sider, og sørg for at kammerets tak ikke kommer i kontakt med glassoverflaten. Plasser kammeret med glassbunnen vendt mot varmeplaten ved 100 grader Celsius i fem minutter.Bruk deretter kammeret umiddelbart, eller oppbevar det i en ren Petri-tallerken i en uke. For å skylle innløps- og utløpsslangen, fyll et reservoarrør på 2 milliliter med 300 mikroliter F-buffer, skru det på mikrofluidisk holder og sett trykket til 300 millibar. La fem til åtte dråper F-buffer gå til spille, sett deretter trykket til null og gjenta prosedyren for hver kanal.Sett deretter trykket for utløpet på reservoarrøret fire til 50 millibar, når en dråpe kommer ut fra slangespissen, koble slangen til utløpet av PDMS-kammeret. Når væsken fyller kammeret og kommer ut av alle innløp, sett utløpstrykket til 20 millibar. Sett senere trykket for reservoarrøret til 1 til 50 millibar.For å unngå å introdusere luftbobler, må du sørge for at en dråpe kommer ut av slangen og PDMS-innløpet før du kobler slangen til innløpsenheten. Sett trykket på innløpet til 30 millibar. Etter å ha koblet innløpene to og tre som demonstrert, sett trykket på alle viker til 20 millibar, og utløpstrykket til null millibar.Sørg for at strømningshastighetene i innløpene er omtrent like. Når du skifter reservoaret, sett alle innløpstrykk til 12 millibar og utløpstrykk til 5 millibar. For raskt å injisere en løsning, sett trykket på det tilsvarende innløpet til 150 millibar, og juster trykket i de andre innløpene til rundt 100 millibar, slik at den resulterende strømningshastigheten i innløpene er 500 nanoliter per minutt.For å endre løsningen, fyll 200 til 300 mikroliter av løsningen i et nytt reservoarrør og sett trykket til endringsinnstillingen. Skru deretter av reservoarrøret på innløpet. Når en liten dråpe har dannet seg på rørspissen, skru inn det nye røret med den friske løsningen, endre trykkinnstillingen til høy strømning.Avhengig av mikrofluidisk konfigurasjon og en kammergeometri, vent i tre til fem minutter på at løsningen skal fylle ut slangen og nå kammeret. Prosessen kan følges ved å måle økningen i fluorescens over tid. For overflatefunksjonalisering, endre løsning tre til 200 mikroliter av 50 picomolar spectrin-aktinfrø i F-buffer, og injiser løsningen i to minutter med høy strømning tre.For overflate passivisering, bytt rør tre med 300 mikroliter på 5% BSA i F-buffer, deretter injisere i fem minutter ved høy strømning tre, etterfulgt av fem minutter ved midten av strømmen tre, med redusert trykk på syv til åtte millibar i kanaler en og to for å få en motstrøm på 100 nanoliters per minutt. Hele kammeroverflaten vil bli BSA passivert. Bytt rør tre til F-buffer for å skylle kanalen i fem minutter ved høy strømning tre.Senere, bytt rør en til tre med en mikromolar actin profilin, 0,15 mikromolar actin, og F buffer, henholdsvis, som forklart i manuskriptet, og injiser nylagde løsninger ved hjelp av høystrømmen alle forhåndsinnstilt i tre til fire minutter. Slå på mikroskopet og juster kameraets eksponeringstid til 100 til 200 millisekunder, eksitasjonslaser til 10 til 20% strøm, og total intern refleksjon fluorescens, eller TIRF-dybde, ved 200 til 300 nanometer for å fange bildene med et 60X mål. Deretter setter du trykkinnstillingen til midtstrøm 1 i 10 minutter for å registrere filamentpolymeriseringen med en hastighet på ett bilde hvert 20.Fang depolymerisering i epifluorescence-modus på ett bilde hvert femte sekund, etter en til to rammer, bytt til midtstrøm tre for å spille inn filamenter som depolymeriserer på rundt 10 underenheter per sekund. For å tilbakestille eksperimentet, bryt alle fluorescerende merkede filamenter ved å kontinuerlig utsette dem for laseren med maksimal effekt i to minutter. Test forskjellige forhold ved å endre løsninger en, to eller tre og injisere dem ved høy strømning i tre til fire minutter.Utfallet av det grunnleggende polymerisasjons-/depolymeriseringseksperimentet presenteres her. De resulterende kymografiene ble brukt til å kvantifisere polymerisasjons- og depolymeriseringsratene. Da de voksne aktinfilamentene ble utsatt for en fluorescerende merket cofilin-løsning, ble cofilinklynger nukleert og vokste mot de spisse og piggede endene.Når enkeltfilamenter blir utsatt for fascin, danner de bunter som ser lysere ut og ikke helt på linje med strømmen. Det er svært viktig å unngå å introdusere luftbobler i systemet når du bytter rør og vær oppmerksom på ikke å få reservoarrørene tomme. Denne teknikken var avgjørende for å bruke trekkkrefter over titalls enkeltfilamenter, se på formin og cofilin mekanisk følsomhet, og ARP2/3 debranching.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Høy-gjennomstrømning total intern refleksjon fluorescens og direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi bruke en fotoniske chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Avbildning av podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med ekspansjonsmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...