Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Мы благодарны Б. Ладу и Р.-М. Лаборатория Mège для использования своего УФ-очистительного оборудования, а также J. Heuvingh и 0. du Roure за первоначальное обучение, которое мы получили по подготовке пресс-форм на кремниевых пластинах и предоставлению советов по микрофлюидике. Мы признаем финансирование из гранта Европейского исследовательского совета StG-679116 (для A.J.) и Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (для G.R.-L.).

1. Подготовка микрофлюидной камеры
<ol><li>Выберите мастер-форму СУ-8 с несколькими камерными узорами. Типичные камеры имеют крестообразную форму с тремя входами и одним выходом, высотой 20 мкм и шириной 800 мкм (рисунок 1). Такие мастер-формы могут быть приобретены у ?...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

По сравнению со стандартными методами с одной нитью, где актиновые нити закреплены на поверхности несколькими точками по их длине или поддерживаются близко к ней с помощью агента скученности, такого как метилцеллюлоза, микрофлюидика предлагает ряд преимуществ. Поскольку взаимодейств...

Сборка и разборка актиновых нитей и сетей актиновых нитей контролируется несколькими биохимическими реакциями и зависит от механического контекста. Чтобы получить представление об этих сложных механизмах, бесценно иметь возможность наблюдать индивидуальные реакции на отдельных нитях (в достаточно большом количестве). За последние десятилетия наблюдение динамических актиновых нитей в режиме реального времени, главным образом с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), стало ключевым методом и обеспечило впечатляющий список результатов, которые не могли быть получены с помощью биохимических анализов объемного раствора1.
Для достижения этого необходимо поддерживать флуоресцентно меченые актиновые нити близко к поверхности крышки микроскопа, подвергая их воздействию растворов актин-связывающих белков (ABP), которые также могут быть флуоресцентно помечены. Это обеспечивает средства для мониторинга событий, происходящих на отдельных нитях в хорошо контролируемых биохимических условиях, и, таким образом, для количественной оценки скорости реакции. Однако следует рассмотреть ряд конкретных ограничений. Искусственное поддержание нитей близко к поверхности, часто благодаря множественным точкам крепления или с помощью скученного агента, такого как метилцеллюлоза, может изменить их поведение (например, вызывая паузы в их полимеризации и деполимеризации2). Отслеживание контура каждой нити накала может быть сложной задачей, особенно если новые нити или фрагменты нити накапливаются в поле зрения с течением времени. Реакции происходят в конечном объеме, где концентрация мономеров актина и ABP может изменяться с течением времени, что потенциально затрудняет получение точных констант скорости. Наконец, возобновление или изменение раствора ABP трудно достичь менее чем за 30 с и часто приводит к неоднородному содержанию белка в образце.
Чуть более 10 лет назад, вдохновленные тем, что уже было сделано для изучения отдельных нитей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)3, мы представили новую технику, основанную на микрофлюидике, для наблюдения и манипулирования отдельными актиновыми нитями4. Это позволяет обойти вышеупомянутые ограничения классических однонитевых техник. В этих анализах микрофлюидики актиновые нити выращиваются из спектрин-актиновых семян, адсорбированных на покровном листе. Таким образом, нити закреплены одним концом только на дне микрофлюидной камеры и колеблются над поверхностью, не прилипая. Нити накаливания выравниваются с потоком поступающих растворов, тем самым облегчая контроль длины их контура и поддерживая их в неглубокой области над крышкой, где можно использовать TIRF. Различные растворы одновременно поступают в камеру без перемешивания, и нити могут подвергаться их последовательному и быстрому воздействию.
Здесь мы предлагаем ряд основных протоколов для создания одноактиновых микрофлюидных анализов в лаборатории. Чехлы и микрофлюидные камеры могут быть подготовлены заранее (за полдня), а сам эксперимент, где можно проверить несколько биохимических состояний, проводится менее чем за сутки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

Чтобы расшифровать сложные молекулярные механизмы, которые регулируют сборку и разборку актиновых нитей, является большим преимуществом для мониторинга отдельных реакций, живущих в хорошо контролируемых условиях. Для этого за последние 20 лет появились живые эксперименты с одной нитью, в основном с использованием микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), и дали множество ключевых результатов. В 2011 году, чтобы еще больше расширить возможности этих экспериментов и избежать повторяющихся проблемных артефактов, мы ввели в эти анализы простую микрофлюидику. В этом исследовании подробно описывается наш основной протокол, где отдельные актиновые нити закреплены одним концом на пассивированной поверхности покрова, выравниваются с потоком и могут последовательно подвергаться воздействию различных белковых растворов. Мы также представляем протоколы для конкретных применений и объясняем, как можно применять контролируемые механические силы благодаря вязкому сопротивлению текучего раствора. Мы выделяем технические предостережения этих экспериментов и кратко представляем возможные разработки, основанные на этой технике. Эти протоколы и объяснения, наряду с сегодняшним наличием простого в использовании оборудования для микрофлюидики, должны позволить неспециалистам реализовать этот анализ в своих лабораториях.

Для всех экспериментов, описанных выше, флуоресцентно меченые актиновые нити должны быть хорошо видны, с хорошим контрастом, указывающим на низкую фоновую флуоресценцию с поверхности (рисунок 4, см. Дополнительный файл 1 для устранения общих проблем). Актиновые ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Мы представляем протоколы для простых микрофлюидных анализов актиновой нити в сочетании с флуоресцентной микроскопией, которые позволяют точно контролировать отдельные актиновые нити в режиме реального времени, последовательно подвергая их воздействию различных белковых растворов.

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Мы объединяем флуоресцентную микроскопию с микрофлюидикой, чтобы изучить, как актин-связывающие белки регулируют сборку и разборку актиновых нитей. С помощью микрофлюидики мы можем количественно оценивать реакции, происходящие на десятках отдельных актиновых нитей одновременно, точно контролируя биохимические и механические условия. Помните, что растворы сначала впрыскиваются параллельно, пока они не достигнут камеры, а затем нити последовательно подвергаются воздействию на каждый раствор путем изменения настройки давления.Чтобы начать приготовление полидиметилсилоксана, или PDMS, камерной сборки, предварительно разогрейте конфорку до 100 градусов Цельсия. Подвергайте одну очищенную камеру PDMS и одну стеклянную крышку в чистой чашке Петри ультрафиолетовому свету в течение трех-пяти минут в глубоком УФ-очистителе. Когда это будет сделано, расположите камеру PDMS над скольжением крышки таким образом, чтобы две поверхности, непосредственно подверженные воздействию ультрафиолета, соприкасались.Чтобы удалить пузырьки воздуха, застрявшие на проскальзывающем интерфейсе крышки PDMS, осторожно прижмите палец к поверхности камеры. Плотно прижмитесь к углам и сторонам, следя за тем, чтобы потолок камеры не соприкасался со стеклянной поверхностью. Поместите камеру со стеклянным дном лицом к конфорке при 100 градусах Цельсия на пять минут.Затем немедленно используйте камеру или храните ее в чистой чашке Петри в течение недели. Чтобы промыть впускную и выходную трубку, заполните одну 2-миллилитровую резервуарную трубку 300 микролитрами F-буфера, прикрутите ее к микрофлюидному держателю и установите давление на 300 миллибар. Пусть пять-восемь капель F-буфера пойдут впустую, затем установите давление до нуля и повторите процедуру для каждого канала.Затем установите давление для выходного отверстия на резервуарной трубке от четырех до 50 миллибар, как только капля выйдет из наконечника трубки, подключите трубку к выходу камеры PDMS. Когда жидкость заполняет камеру и выходит из всех входов, установите давление на выходе на 20 миллибар. Позже установите давление для резервуарной трубы на уровне от 1 до 50 миллибар.Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, убедитесь, что капля выходит из трубки и входного отверстия PDMS, прежде чем подключать трубку к входной. Установите давление на входе в 30 миллибар. После соединения входных отверстий два и три, как показано, установите давление всех входов на 20 миллибар, а давление на выходе на нулевом миллибаре.Убедитесь, что скорость потока во входных отверстиях примерно равна. При смене резервуара установите все давление на входе в 12 миллибар и давление на выходе на 5 миллибар. Чтобы быстро ввести раствор, установите давление соответствующего входного отверстия в 150 миллибар и отрегулируйте давление в других входах примерно до 100 миллибар, так что результирующая скорость потока во входных отверстиях составляет 500 нанолитров в минуту.Чтобы изменить раствор, заполните от 200 до 300 микролитров раствора в новую резервуарную трубу и установите давление на изменение настройки. Затем открутите резервуарную трубу входного отверстия. После того, как на кончике трубки образовалась небольшая капля, вкрутите новую трубку со свежим раствором, измените настройку давления на высокий поток.В зависимости от микрофлюидной конфигурации и геометрии камеры подождите от трех до пяти минут, пока раствор заполнит трубку и достигнет камеры. Процесс может сопровождаться измерением увеличения флуоресценции с течением времени. Для функционализации поверхности измените раствор от трех до 200 микролитров 50 пикомолярных спектрин-актиновых семян в F-буфере и вводят раствор в течение двух минут с высоким потоком три.Для поверхностной пассивации замените третью трубку с 300 микролитрами 5% BSA в F-буфере, затем введите в течение пяти минут при высоком потоке три, затем пять минут в середине потока три, со сниженным давлением от семи до восьми миллибар в каналах один и два, чтобы получить противоток 100 нанолитров в минуту. Вся поверхность камеры будет пассивирована BSA. Замените третью трубку на F-буфер, чтобы промыть канал в течение пяти минут при высоком потоке три.Позже замените трубки от одного до трех с одним микромолярным актином профилином, 0,15 микромолярным актином и буфером F соответственно, как объясняется в рукописи, и вводят свежеприготовленные растворы с использованием высокого потока, все предустановлено в течение трех-четырех минут. Включите микроскоп и отрегулируйте время экспозиции камеры до 100-200 миллисекунд, лазер возбуждения до 10-20% мощности и общую флуоресценцию внутреннего отражения, или глубину TIRF, на расстоянии от 200 до 300 нанометров для захвата изображений с объективом 60X. Затем установите установку давления на средний поток в течение 10 минут, чтобы записать полимеризацию нити накала со скоростью одного кадра каждые 20 секунд, а затем средний поток два в течение 15 минут для старения нити.Захват деполимеризации в режиме эпифлуоресценции на одном кадре каждые пять секунд, после одного-двух кадров, переключается на средний поток три, чтобы записать деполимеризацию нитей со скоростью около 10 субъединиц в секунду. Чтобы сбросить эксперимент, разорвите все флуоресцентно меченые нити, непрерывно подвергая их воздействию лазера с максимальной мощностью в течение двух минут. Испытайте различные условия, заменив растворы один, два или три и впрыскивая их при высоком потоке в течение трех-четырех минут.Здесь представлен результат основного эксперимента полимеризации/деполимеризации. Полученные кимографы использовались для количественной оценки скорости полимеризации и деполимеризации. Когда выращенные актиновые нити подвергались воздействию флуоресцентно меченого раствора кофилина, кластеры кофилина зарождались и росли к заостренным и колючим концам.Когда одиночные нити подвергаются воздействию фасцина, они образуют пучки, которые кажутся более яркими и не идеально выровненными с потоком. Очень важно избегать введения пузырьков воздуха в систему при смене трубок и обращать внимание на то, чтобы резервуарные трубы не пустели. Этот метод имел решающее значение для применения силы притяжения к десяткам одиночных нитей, изучения механической чувствительности формина и кофилина и деветрации ARP2/3.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...