Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Agradecemos a B. Ladoux y R.-M. Mège lab para el uso de sus equipos de limpieza UV, y J. Heuvingh y 0. du Roure para la capacitación inicial que recibimos sobre la preparación de moldes en obleas de silicio y la provisión de consejos sobre microfluídica. Reconocemos la financiación de la subvención StG-679116 del Consejo Europeo de Investigación (a A.J.) y las becas de la Agence Nationale de la Recherche Muscactin y Conformin (a G.R.-L.).

1. Preparación de la cámara microfluídica
<ol><li>Seleccione un molde maestro SU-8 con varios patrones de cámara. Las cámaras típicas tienen forma de cruz con tres entradas y una salida, 20 μm de alto y 800 μm de ancho (Figura 1). Dichos moldes maestros pueden comprarse a empresas externas o fabricarse en laboratorios académicos (por ejemplo, Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Coloque cinta adhesiva alrededor del borde del molde.<ol>
<li>Coloq...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

En comparación con los métodos estándar de filamento único en los que los filamentos de actina están anclados a la superficie por múltiples puntos a lo largo de su longitud o mantenidos cerca de ella por un agente de apiñamiento como la metilcelulosa, la microfluídica ofrece una serie de ventajas. Como las interacciones con la superficie son mínimas, se evitan las pausas artificiales que estas interacciones pueden inducir durante el alargamiento y la despolimerización. Los filamentos están alineados por el flu...

El montaje y desmontaje de filamentos de actina y redes de filamentos de actina están controlados por varias reacciones bioquímicas y dependen del contexto mecánico. Para obtener información sobre estos complejos mecanismos, es invaluable poder observar reacciones individuales en filamentos individuales (en cantidades suficientemente grandes). En las últimas décadas, la observación de filamentos dinámicos de actina en tiempo real, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), se ha convertido en una técnica clave y ha proporcionado una impresionante lista de resultados que no se podrían haber obtenido con ensayos bioquímicos de solución a granel1.
Para lograr esto, es necesario mantener los filamentos de actina marcados fluorescentemente cerca de la superficie de la cubierta del microscopio mientras se exponen a soluciones de proteínas de unión a actina (ABP), que también pueden ser marcadas fluorescentemente. Hacerlo proporciona un medio para monitorear los eventos que tienen lugar en filamentos individuales en condiciones bioquímicas bien controladas y, por lo tanto, cuantificar las velocidades de reacción. Sin embargo, deben considerarse una serie de limitaciones específicas. El mantenimiento artificial de los filamentos cerca de la superficie, a menudo gracias a múltiples puntos de anclaje o mediante el uso de un agente de apiñamiento como la metilcelulosa, puede alterar su comportamiento (por ejemplo, causando pausas en su polimerización y despolimerización2). El seguimiento del contorno de cada filamento puede ser un desafío, especialmente si se acumulan nuevos filamentos o fragmentos de filamento en el campo de visión con el tiempo. Las reacciones tienen lugar en un volumen finito donde la concentración de monómeros de actina y ABP puede variar con el tiempo, lo que potencialmente dificulta la obtención de constantes de velocidad precisas. Finalmente, renovar o cambiar la solución de ABP es difícil de lograr en menos de 30 s y a menudo conducirá a un contenido de proteína no homogéneo en la muestra.
Hace poco más de 10 años, inspirados por lo que ya se hizo para estudiar las hebras individuales de ácido desoxirribonucleico (ADN)3, introdujimos una nueva técnica basada en microfluídica para observar y manipular filamentos de actina individuales4. Permite eludir las limitaciones antes mencionadas de las técnicas clásicas de filamento único. En estos ensayos de microfluídica, los filamentos de actina se cultivan a partir de semillas de espectrina-actina adsorbidas en el cobertor. Por lo tanto, los filamentos se anclan por un extremo solo a la parte inferior de la cámara microfluídica y fluctúan por encima de la superficie sin pegarse. Los filamentos se alinean con el flujo de las soluciones entrantes, lo que facilita el monitoreo de la longitud de su contorno y los mantiene en una región poco profunda por encima del espolón donde se puede usar TIRF. Diferentes soluciones fluyen simultáneamente en la cámara sin mezclarse, y los filamentos se pueden exponer a ellas secuencial y rápidamente.
Aquí, proponemos una serie de protocolos básicos para establecer ensayos de microfluídica de filamento de actina única en el laboratorio. Las cámaras de coverslips y microfluidos se pueden preparar con anticipación (en medio día), y el experimento en sí, donde se pueden probar varias condiciones bioquímicas, se realiza en menos de un día.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

Con el fin de descifrar los complejos mecanismos moleculares que regulan el ensamblaje y desmontaje de los filamentos de actina, es un gran activo monitorear las reacciones individuales en vivo en condiciones bien controladas. Para hacerlo, han surgido experimentos en vivo de un solo filamento en los últimos 20 años, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), y han proporcionado un tesoro de resultados clave. En 2011, con el fin de ampliar aún más las posibilidades de estos experimentos y evitar artefactos problemáticos recurrentes, introdujimos microfluídica simple en estos ensayos. Este estudio detalla nuestro protocolo básico, donde los filamentos de actina individuales se anclan por un extremo a la superficie pasivada de la cubierta, se alinean con el flujo y pueden exponerse sucesivamente a diferentes soluciones proteicas. También presentamos los protocolos para aplicaciones específicas y explicamos cómo se pueden aplicar las fuerzas mecánicas controladas, gracias al arrastre viscoso de la solución que fluye. Destacamos las advertencias técnicas de estos experimentos y presentamos brevemente los posibles desarrollos basados en esta técnica. Estos protocolos y explicaciones, junto con la disponibilidad actual de equipos de microfluídica fáciles de usar, deberían permitir a los no especialistas implementar este ensayo en sus laboratorios.

Para todos los experimentos descritos anteriormente, los filamentos de actina marcados fluorescentemente deben ser claramente visibles, con buen contraste, indicativos de baja fluorescencia de fondo desde la superficie (Figura 4, consulte el Archivo complementario 1 para la solución de problemas comunes). Los filamentos de actina tampoco deben adherirse a la superficie: cuando el caudal dominante es bajo, las fluctuaciones laterales de los filamentos de actina deben ser per...

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Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Combinamos la microscopía de fluorescencia con la microfluídica para estudiar cómo las proteínas de unión a la actina regulan el ensamblaje y el desmontaje de los filamentos de actina. Con la microfluídica, podemos cuantificar las reacciones que ocurren en decenas de filamentos de actina individuales simultáneamente, mientras controlamos con precisión las condiciones bioquímicas y mecánicas. Recuerde que las soluciones se inyectan primero en paralelo hasta que llegan a la cámara, y luego, los filamentos se exponen secuencialmente a cada solución cambiando el ajuste de presión.Para comenzar la preparación del ensamblaje de la cámara de polidimetilsiloxano, o PDMS, precaliente la placa caliente a 100 grados centígrados. Exponga una cámara PDMS limpia y una cubierta de vidrio en una placa de Petri limpia a la luz ultravioleta durante tres a cinco minutos en un limpiador UV profundo. Cuando haya terminado, coloque la cámara PDMS sobre el deslizamiento de la cubierta de modo que las dos superficies expuestas directamente a los rayos UV se pongan en contacto.Para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la interfaz deslizante de la cubierta PDMS, presione suavemente la superficie de la cámara con un dedo. Presione fuertemente sobre las esquinas y los lados, asegurándose de que el techo de la cámara no entre en contacto con la superficie de vidrio. Coloque la cámara con el fondo de vidrio mirando hacia la placa caliente a 100 grados centígrados durante cinco minutos.Luego use la cámara inmediatamente o guárdela en una placa de Petri limpia durante una semana. Para enjuagar el tubo de entrada y salida, llene un tubo de depósito de 2 mililitros con 300 microlitros de F-buffer, atorníllelo en el soporte microfluídico y ajuste la presión a 300 milibares. Deje que se desperdicien de cinco a ocho gotas de F-buffer, luego establezca la presión en cero y repita el procedimiento para cada canal.A continuación, ajuste la presión para la salida en el tubo del depósito de cuatro a 50 milibares, una vez que salga una gota de la punta del tubo, conecte el tubo a la salida de la cámara PDMS. A medida que el líquido llena la cámara y sale de todas las entradas, ajuste la presión de salida a 20 milibares. Más tarde, ajuste la presión para el tubo del depósito a 1 a 50 milibares.Para evitar la introducción de burbujas de aire, asegúrese de que salga una gota del tubo y de la entrada PDMS antes de conectar el tubo a uno de entrada. Ajuste la presión de la entrada a 30 milibares. Después de conectar las entradas dos y tres, como se ha demostrado, ajuste la presión de todas las entradas a 20 milibares y la presión de salida a cero milibares.Asegúrese de que los caudales en las entradas sean aproximadamente iguales. Al cambiar el depósito, ajuste todas las presiones de entrada a 12 milibares y la presión de salida a 5 milibares. Para inyectar rápidamente una solución, ajuste la presión de la entrada correspondiente a 150 milibares y ajuste la presión en las otras entradas a alrededor de 100 milibares, de modo que el caudal resultante en las entradas sea de 500 nanolitros por minuto.Para cambiar la solución, llene de 200 a 300 microlitros de la solución en un nuevo tubo de depósito y ajuste la presión a la configuración de cambio. Luego, desenrosque el tubo del depósito de la entrada. Una vez que se haya formado una pequeña gota en la punta del tubo, atornille el tubo nuevo con la solución fresca, cambie el ajuste de presión a alto flujo.Dependiendo de la configuración microfluídica y la geometría de la cámara, espere de tres a cinco minutos para que la solución llene el tubo y llegue a la cámara. El proceso se puede seguir midiendo el aumento de la fluorescencia a lo largo del tiempo. Para la funcionalización de la superficie, cambie la solución tres a 200 microlitros de 50 semillas picomolares de espectrina-actina en F-buffer, e inyecte la solución durante dos minutos con tres de alto flujo.Para la pasivación superficial, cambie el tubo tres con 300 microlitros de 5% BSA en F-buffer, luego, inyecte durante cinco minutos a alto flujo tres, seguido de cinco minutos a medio flujo tres, con presión reducida de siete a ocho milibares en los canales uno y dos para obtener un contraflujo de 100 nanolitros por minuto. Toda la superficie de la cámara será pasivada por BSA. Cambie el tubo tres a F-buffer para enjuagar el canal durante cinco minutos a un flujo alto tres.Más tarde, cambie los tubos de uno a tres con una profilina de actina micromolar, actina micromolar de 0,15 y tampón F, respectivamente, como se explica en el manuscrito, e inyecte soluciones recién preparadas utilizando el alto flujo preestablecido durante tres a cuatro minutos. Encienda el microscopio y ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 100 a 200 milisegundos, el láser de excitación a 10 a 20% de potencia y la fluorescencia de reflexión interna total, o profundidad TIRF, a 200 a 300 nanómetros para capturar las imágenes con un objetivo de 60X. A continuación, ajuste el ajuste de presión a flujo medio uno durante 10 minutos para registrar la polimerización del filamento a la velocidad de un fotograma cada 20 segundos, seguido de flujo medio dos durante 15 minutos para el envejecimiento del filamento.Capture la despolimerización en el modo de epifluorescencia a un fotograma cada cinco segundos, después de uno o dos fotogramas, cambie a flujo medio tres para registrar filamentos despolimerizando a alrededor de 10 subunidades por segundo. Para restablecer el experimento, rompa todos los filamentos marcados fluorescentemente exponiéndolos continuamente al láser a máxima potencia durante dos minutos. Pruebe diferentes condiciones cambiando las soluciones uno, dos o tres e inyectándolas a alto flujo durante tres o cuatro minutos.El resultado del experimento básico de polimerización/despolimerización se presenta aquí. Los kymographs resultantes se utilizaron para cuantificar las tasas de polimerización y despolimerización. Cuando los filamentos de actina cultivados fueron expuestos a una solución de cofilina marcada fluorescentemente, los racimos de cofilina se nuclearon y crecieron hacia los extremos puntiagudos y con púas.Cuando los filamentos individuales se exponen a la fasina, forman haces que parecen más brillantes y no están perfectamente alineados con el flujo. Es muy importante evitar introducir burbujas de aire en el sistema al cambiar de tubo y prestar atención a no vaciar los tubos del depósito. Esta técnica fue fundamental para aplicar fuerzas de tracción sobre decenas de filamentos individuales, observar la sensibilidad mecánica de la formina y la cofilina, y el desramado ARP2/3.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

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Investigación

Bioquímica

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

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