Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Vi är tacksamma mot B. Ladoux och R.-M. Mège lab för användning av deras UV-renare utrustning, och J. Heuvingh och 0. du Roure för den inledande utbildningen vi fick om att förbereda formar på kiselskivor och ge tips om mikrofluidik. Vi erkänner finansiering från European Research Council Grant StG-679116 (till AJ) och Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin och Conformin (till G.R.-L.).

1. Förberedelse av mikrofluidikkammare
<ol><li>Välj en SU-8 masterform med flera kammarmönster. Typiska kamrar är korsformade med tre inlopp och ett utlopp, 20 μm högt och 800 μm brett (figur 1). Sådana huvudformar kan köpas från externa företag eller tillverkas i akademiska laboratorier (t.ex. Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Placera tejp runt formens kant.<ol>
<li>Lägg ~50 cm lång, 19 mm bred, standard transparent kontorstejp (se <stro...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Jämfört med vanliga metoder med enfilament där aktinfilament förankras på ytan med flera punkter längs deras längd eller hålls nära den av ett trängselmedel såsom metylcellulosa, erbjuder mikrofluidik ett antal fördelar. Eftersom interaktioner med ytan är minimala undviks de konstgjorda pauser som dessa interaktioner kan inducera under både förlängning och depolymerisation. Filamenten är inriktade på flödet, parallellt med varandra, vilket underlättar deras övervakning och mätning av deras längder....

Montering och demontering av aktinfilament och aktinfilamentnätverk styrs av flera biokemiska reaktioner och beror på det mekaniska sammanhanget. För att få insikt i dessa komplexa mekanismer är det ovärderligt att kunna observera individuella reaktioner på enskilda filament (i tillräckligt stort antal). Under de senaste decennierna har observationen av dynamiska aktinfilament i realtid, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, framstått som en nyckelteknik och har gett en imponerande lista över resultat som inte kunde ha erhållits med biokemiska analyser av bulklösning1.
För att uppnå detta måste man behålla fluorescerande märkta aktinfilament nära ytan på mikroskopets täckglas medan man utsätter dem för lösningar av aktinbindande proteiner (ABP), som också kan märkas fluorescerande. Att göra det ger ett sätt att övervaka händelser som äger rum på enskilda filament under välkontrollerade biokemiska förhållanden och därmed kvantifiera reaktionshastigheter. Ett antal specifika begränsningar bör dock övervägas. Artificiellt underhåll av filament nära ytan, ofta tack vare flera förankringspunkter eller genom att använda ett trängselmedel såsom metylcellulosa, kan förändra deras beteende (t.ex. orsaka pauser i deras polymerisation och depolymerisation2). Att spåra konturen för varje filament kan vara utmanande, särskilt om nya filament eller filamentfragment ackumuleras i synfältet över tiden. Reaktionerna sker i en ändlig volym där koncentrationen av aktinmonomerer och ABP kan variera över tid, vilket potentiellt gör det svårt att härleda exakta hastighetskonstanter. Slutligen är det svårt att förnya eller ändra lösningen av ABPs på mindre än 30 s och leder ofta till inhomogent proteininnehåll i provet.
För drygt 10 år sedan, inspirerade av vad som redan gjorts för att studera enskilda DNA-strängar (Deoxyribonukleinsyra) 3, introducerade vi en ny teknik baserad på mikrofluidik för att observera och manipulera enskilda aktinfilament4. Det gör att man kan kringgå de ovan nämnda begränsningarna för klassiska tekniker med enfilament. I dessa mikrofluidikanalyser odlas aktinfilament från spektrin-aktinfrön adsorberade på täckglaset. Filament förankras således av ena änden endast till botten av den mikrofluidiska kammaren och fluktuerar ovanför ytan utan att fastna. Filamenten anpassar sig till flödet av inkommande lösningar, vilket underlättar övervakningen av deras konturlängd och bibehåller dem i ett grunt område ovanför täckglaset där TIRF kan användas. Olika lösningar flödas samtidigt in i kammaren utan blandning, och filamenten kan utsättas för dem sekventiellt och snabbt.
Här föreslår vi en serie grundläggande protokoll för att ställa in mikrofluidikanalyser med en aktinfilament i labbet. Coverslips och mikrofluidikkammare kan förberedas i förväg (på en halv dag), och själva experimentet, där flera biokemiska förhållanden kan testas, görs på mindre än en dag.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

För att dechiffrera de komplexa molekylära mekanismerna som reglerar montering och demontering av aktinfilament är det en stor tillgång att övervaka individuella reaktioner som lever under välkontrollerade förhållanden. För att göra det har levande experiment med enfilament dykt upp under de senaste 20 åren, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, och har gett en mängd viktiga resultat. Under 2011, för att ytterligare utöka möjligheterna med dessa experiment och för att undvika återkommande problematiska artefakter, introducerade vi enkla mikrofluidik i dessa analyser. Denna studie beskriver vårt grundläggande protokoll, där enskilda aktinfilament förankras i ena änden till den passiverade täckglasytan, anpassar sig till flödet och kan successivt utsättas för olika proteinlösningar. Vi presenterar också protokollen för specifika applikationer och förklarar hur kontrollerade mekaniska krafter kan appliceras tack vare den strömmande lösningens viskösa drag. Vi lyfter fram de tekniska försiktighetsåtgärderna för dessa experiment och presenterar kortfattat möjliga utvecklingar baserade på denna teknik. Dessa protokoll och förklaringar, tillsammans med dagens tillgång till lättanvänd mikrofluidikutrustning, bör göra det möjligt för icke-specialister att implementera denna analys i sina laboratorier.

För alla experiment som beskrivs ovan bör fluorescerande märkta aktinfilament vara tydligt synliga, med god kontrast, vilket indikerar låg bakgrundsfluorescens från ytan (figur 4, se tilläggsfil 1 för felsökning av vanliga problem). Aktinfilament bör inte heller hålla fast vid ytan: när den dominerande flödeshastigheten är låg bör aktinfilamentens laterala fluktuationer vara märkbara när man observerar dem levande och låta en tydligt bestämma att de endast...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Vi presenterar protokoll för enkla aktinfilamentmikrofluidiska analyser, i kombination med fluorescensmikroskopi, som gör att man exakt kan övervaka enskilda aktinfilament i realtid samtidigt som man sekventiellt utsätter dem för olika proteinlösningar.

Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Vi kombinerar fluorescensmikroskopi med mikrofluidik för att studera hur aktinbindande proteiner reglerar montering, och demontering, av aktinfilament. Med mikrofluidik kan vi kvantifiera reaktioner som sker på tiotals enskilda aktinfilament samtidigt, samtidigt som vi exakt kontrollerar biokemiska och mekaniska förhållanden. Kom ihåg att lösningar först injiceras parallellt tills de når kammaren, och sedan exponeras filament sekventiellt för varje lösning genom att ändra tryckinställningen.För att starta beredningen av polydimetylsiloxan, eller PDMS, kammarenhet, förvärm värmeplattan till 100 grader Celsius. Exponera en rengjord PDMS-kammare och ett glaslock i en ren petriskål för ultraviolett ljus i tre till fem minuter i en djup UV-rengörare. När du är klar, placera PDMS-kammaren över locket så att de två ytorna som är direkt utsatta för UV kommer i kontakt.För att ta bort luftbubblor som fångats vid PDMS-täckglidningsgränssnittet, tryck försiktigt på kammarens yta med ett finger. Tryck starkt över hörn och sidor och se till att kammarens tak inte kommer i kontakt med glasytan. Placera kammaren med glasbotten mot kokplattan vid 100 grader Celsius i fem minuter.Använd sedan kammaren omedelbart, eller förvara den i en ren petriskål i en vecka. För att skölja inlopps- och utloppsslangen, fyll ett 2 ml reservoarrör med 300 mikroliter F-buffert, skruva fast det på mikrofluidikhållaren och ställ in trycket på 300 millibar. Låt fem till åtta droppar F-buffert gå till spillo, ställ sedan in trycket på noll och upprepa proceduren för varje kanal.Ställ sedan in trycket för utloppet på reservoarröret fyra till 50 millibar, när en droppe kommer ut från slangspetsen, anslut slangen till PDMS-kammarens utlopp. När vätskan fyller kammaren och kommer ut ur alla inlopp, ställ in utloppstrycket på 20 millibar. Ställ senare in trycket för reservoarröret till 1 till 50 millibar.För att undvika att införa luftbubblor, se till att en droppe kommer ut ur slangen och PDMS-inloppet innan du ansluter slangen till inlopp ett. Ställ in inloppets tryck på 30 millibar. Efter anslutning av inloppen två och tre som visas, ställ in trycket på alla inlopp till 20 millibar och utloppstrycket till noll millibar.Se till att flödeshastigheterna i inloppen är ungefär lika. När du byter behållare, ställ in alla inloppstryck på 12 millibar och utloppstrycket på 5 millibar. För att snabbt injicera en lösning, ställ in trycket för motsvarande inlopp till 150 millibar och justera trycket i de andra inloppen till cirka 100 millibar, så att den resulterande flödeshastigheten i inloppen är 500 nanoliter per minut.För att ändra lösningen, fyll 200 till 300 mikroliter av lösningen i ett nytt reservoarrör och ställ in trycket på ändringsinställningen. Skruva sedan loss inloppets reservoarrör. När en liten droppe har bildats vid slangspetsen, skruva in det nya röret med den färska lösningen, ändra tryckinställningen till högt flöde.Beroende på den mikrofluidiska konfigurationen och en kammargeometri, vänta i tre till fem minuter tills lösningen fyller i slangen och når kammaren. Processen kan följas genom att mäta ökningen av fluorescens över tid. För ytfunktionaliseringen, byt lösning tre till 200 mikroliter av 50 picomolära spektrin-aktinfrön i F-buffert och injicera lösningen i två minuter med högt flöde tre.För ytpassiveringen, byt rör tre med 300 mikroliter på 5% BSA i F-buffert, injicera sedan i fem minuter vid högt flöde tre, följt av fem minuter vid mitten av flöde tre, med reducerat tryck på sju till åtta millibar i kanaler ett och två för att få ett motflöde på 100 nanoliter per minut. Hela kammarytan kommer att vara BSA-passiverad. Byt rör tre till F-buffert för att skölja kanalen i fem minuter vid högt flöde tre.Senare byter du rör ett till tre med ett mikromolärt aktinprofilin, 0,15 mikromolärt aktin respektive F-buffert, som förklaras i manuskriptet, och injicerar nyberedda lösningar med hjälp av det höga flödet alla förinställda i tre till fyra minuter. Slå på mikroskopet och justera kamerans exponeringstid till 100 till 200 millisekunder, excitationslaser till 10 till 20% effekt och total intern reflektionsfluorescens, eller TIRF-djup, vid 200 till 300 nanometer för att fånga bilderna med ett 60X-mål. Ställ sedan in tryckinställningen på mittflöde ett i 10 minuter för att registrera filamentpolymerisationen med en rams hastighet var 20: e sekund, följt av mittflöde två i 15 minuter för filamentåldring.Fånga depolymerisering i epifluorescensläget vid en ram var femte sekund, efter en till två ramar, växla till mittflöde tre för att spela in filament som depolymeriseras med cirka 10 underenheter per sekund. För att återställa experimentet, bryt alla fluorescerande märkta filament genom att kontinuerligt utsätta dem för lasern med maximal effekt i två minuter. Testa olika förhållanden genom att ändra lösningar ett, två eller tre och injicera dem vid högt flöde i tre till fyra minuter.Resultatet av det grundläggande polymerisations-/depolymerisationsexperimentet presenteras här. De resulterande kymograferna användes för att kvantifiera polymerisations- och depolymerisationshastigheterna. När de odlade aktinfilamenten exponerades för en fluorescerande märkt cofilinlösning, kärnades cofilinkluster och växte mot de spetsiga och taggiga ändarna.När enstaka filament utsätts för fascin bildar de buntar som verkar ljusare och inte perfekt anpassade till flödet. Det är mycket viktigt att undvika att införa luftbubblor i systemet när du byter rör och var uppmärksam på att inte få reservoarrör tomma. Denna teknik var avgörande för att applicera dragkrafter över tiotals enstaka filament, titta på formin och cofilin mekanisk känslighet och ARP2/3 debranching.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hög genomströmning total intern reflektions fluorescens och direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi med ett Fotoniskt chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Avbildning av podocytiska proteiner Nephrin, Actin och Podocin med expansionsmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...