Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

نود أن نشيد بالدعم المقدم من الجائزة التجريبية لكلية الطب البيطري والعلوم الطبية الحيوية وبرنامج البحوث المشتركة لمجلس أبحاث الكلية إلى NKG والتمويل المقدم من ATCC (الجائزة رقم 2016-0550-0002) إلى KMD. نود أيضا أن نشيد بآن سيمبسون على الدعم الفني و BEI Resources و NIAID و NIH على الكواشف التالية: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) ، IT-54 (المنتجة في المختبر) ، NR-13792 ، Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c) ، Clone IT-3 (SA-12) (المنتجة في المختبر) ، NR-49223 ، و Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM ، Clone CS-35 (المنتجة في المختبر) ، NR-13811.

وافقت اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية بجامعة ولاية كولورادو على هذه الدراسة (19-046B). تم تنفيذ زراعة المتفطرة السلية وحصاد المواد الفائقة للزراعة الغنية بالمركبات الكهربائية من قبل موظفين مدربين في مختبر عالي الاحتواء. تم نقل المواد من منطقة الاحتواء العالي بعد تنفيذ طريقة تعطيل صا?...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية هي خزانات مستضدية للغاية ، والتي تقدمها كوسيلة جذابة لتطوير أدوات التشخيص واللقاحات المستقبلية4،19،20. تاريخيا ، تم استخدام الطرد المركزي الفائق التدرج للكثافة لفصل Mtb EVs عن المواد الأخرى القابل?...

قد يكون إطلاق الحويصلة خارج الخلية (EV) بواسطة مسببات الأمراض هو المفتاح لفتح تقنيات جديدة للسيطرة على الأمراض المعدية1. المتفطرة السلية (Mtb) هي عامل ممرض ذو عواقب عالية ، حيث تصيب ما يقرب من ثلث سكان العالم وتودي بحياة الملايين من الناس كل عام2. إنتاج EV بواسطة Mtb موثق جيدا ولكنه بعيد المنال في التكوين الحيوي والأدوار المتنوعة (أي المحفزات المناعية ، المثبطة للمناعة ، اكتساب الحديد والمغذيات) لهذه المركبات الكهربائية في سياق العدوى3،4،5. كشفت الجهود المبذولة لفهم تكوين Mtb EVs عن 50-150 نانومتر من الكرات المغلقة بالغشاء الدهني المشتقة من غشاء البلازما الذي يحتوي على الدهون والبروتينات ذات الأهمية المناعية 3,6. كشف التحقيق في دور Mtb EVs في علم وظائف الأعضاء البكتيرية عن أهمية تعديل EV البكتيري استجابة للإجهاد البيئي للبقاء على قيد الحياة5. كانت دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض أكثر تعقيدا في تفسيرها ، لكن الأدلة تشير إلى أن Mtb EVs يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية للمضيف وقد تكون بمثابة مكون تطعيم فعال 3,4,7.
اعتمدت معظم الدراسات التي أجريت على المركبات الكهربائية Mtb حتى الآن على الطرد المركزي المتدرج للكثافة لتخصيب الحويصلة8. وكان ذلك فعالا بالنسبة للدراسات الصغيرة النطاق؛ ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لديها العديد من التحديات التقنية واللوجستية. تجمع مهام سير العمل البديلة بين الطرد المركزي متعدد الخطوات ، لإزالة الخلايا الكاملة والحطام الكبير ، مع خطوة الطرد المركزي الفائق النهائية لتكوير المركبات الكهربائية. يمكن أن تختلف هذه المنهجية في الكفاءة ، وغالبا ما تؤدي إلى انخفاض الغلة والتنقية المشتركة للجزيئات الحيوية غير الحويصلة القابلة للذوبان مع التأثير أيضا على سلامة الحويصلة9. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ومكثفة يدويا ومحدودة للغاية في الإنتاجية بسبب قيود المعدات.
يصف البروتوكول الحالي تقنية بديلة للطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). وقد تم إثبات هذه الطريقة للمتفطرات البيئية ، وفي العمل الحالي ، تم استقرائها إلى Mtb10. يمكن للعمود المتاح تجاريا وجامع الكسور التلقائي تحسين الاتساق في التحضير الحويصلي وتقليل الحاجة إلى معدات محددة ومكلفة. من الممكن أيضا إكمال هذا البروتوكول في جزء صغير من الوقت مقارنة بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يزيد من الإنتاجية. هذه التقنية أقل تحديا من الناحية الفنية ، مما يجعل من السهل إتقانها ، ويمكن أن تزيد من قابلية التكرار بين / داخل المختبر. أخيرا ، تتمتع SEC بكفاءة فصل عالية وهي لطيفة ، مما يحافظ على سلامة الحويصلات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

ظهر دور الحويصلات خارج الخلية (EVs) في سياق العدوى البكتيرية كوسيلة جديدة لفهم فسيولوجيا الميكروبات. على وجه التحديد ، تلعب المركبات الكهربائية المتفطرة السلية (Mtb) دورا في التفاعل بين المضيف والممرض والاستجابة للإجهاد البيئي. كما أن المركبات الكهربائية Mtb مستضدية للغاية وتظهر إمكانات كمكونات للقاح. الطريقة الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية Mtb هي الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه العملية لها العديد من القيود ، بما في ذلك الإنتاجية المنخفضة ، والعائد المنخفض ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتحديات التقنية ، ويمكن أن تؤثر سلبا على التحضير الناتج. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) هي طريقة بديلة ألطف تحارب العديد من قيود الطرد المركزي الفائق. يوضح هذا البروتوكول أن SEC فعالة في إثراء Mtb EV وتنتج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة لزيادة الإنتاجية بطريقة سريعة وقابلة للتطوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقارنة مع الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة من خلال إجراءات القياس الكمي والتأهيل توضح فوائد SEC. في حين أن تقييم كمية EV (تحليل تتبع الجسيمات النانوية) ، والنمط الظاهري (المجهر الإلكتروني للإرسال) ، والمحتوى (النشاف الغربي) مصمم خصيصا ل Mtb EVs ، يمكن تطبيق سير العمل المقدم على المتفطرات الأخرى.

تم تركيز بروتين ترشيح الثقافة (CFP) من المتفطرة السلية (Mtb) ، وتحديد كميته ، ثم تم تطبيق 3 ملغ من المواد على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). تم تعداد تركيزات البروتين والجسيمات بواسطة BCA و NTA ، على التوالي. وترد في الجدول 1 النطاقات المتوقعة لاستعادة البروتين والجسيمات بالإض?...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

يصف هذا البروتوكول كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهي تقنية سهلة وقابلة للتكرار لإثراء المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية من supernatants الثقافة.

المتفطرة السلية إثراء الحويصلات خارج الخلية من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

يقلل هذا البروتوكول من التعقيد التقني والوقت اللازم لإثراء الحويصلات خارج الخلية من المتفطرة السلية ، Mtb EVs. يوفر بديلا لطيفا للطرد المركزي الفائق التقليدي والتقنيات القائمة على الكثافة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء ، مما يجعلها أكثر قابلية للتكرار.يوفر إنتاجية عالية من Mtb EVs مع الحد الأدنى من التخصيب المشترك للبروتين غير EV. ستوضح الإجراء جواني رايان ، وهي طالبة دراسات عليا سابقة في مختبرنا. للبدء ، قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي يبلغ 100 كيلودالتون عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة ل PBS.جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 2،800 مرة G عند 4 درجات مئوية. تخلص من التدفق وأي PBS متبقي ، واملأ غرفة العينة ب Mtb CFP إلى سعتها القصوى. جهاز طرد مركزي عند 2،800 مرة G عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق.كرر حسب الضرورة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف. أضف 1X PBS إلى وحدة التصفية التي تحتوي على التركيز حتى إجمالي سعة الجهاز. قلل مستوى الصوت كما هو موضح من قبل وكرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل وتبديل المخزن المؤقت.بعد ذلك ، قم باستعادة 100 كيلودالتون مركز CFP retentate أو 100R ، وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق. اغسل الفلتر بأقل حجم 1X PBS ثلاث مرات على الأقل ، واسحب الغسيل باستخدام 100R لتحقيق أقصى قدر من الاسترداد. استخدم عدة تخفيفات للعينات في PBS وقم بقياس كمية مادة 100R باستخدام فحص bicinchoninic.اختبار العينة في ثلاثة أضعاف. اسمح لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، أو عمود SEC، بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل AFC باستخدام مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من وحدة البرج واضغط على الإعداد على شاشة اللمس في القائمة الرئيسية إذا لزم الأمر لضبط إعدادات خلية التحميل.من شاشة الإعداد، قم بمحاذاة الدوار عن طريق تحديد دائري متبوعا بمعايرة. أدخل الدوار مع 13 ثقبا صغيرا متجها إلى أعلى في برج AFC واضبط الدوار عن طريق الضغط على زري ناقص أو زائد بحيث تكون فوهة السائل فوق موضع التدفق مباشرة. قم بإزالة الأحرف الكبيرة من عمود SEC المتوازن وحرك عمود SEC في حامل العمود المناسب.قم بتثبيته بعناية على برج الاتحاد الآسيوي لكرة القدم. تأكد من أن علامة تعريف التردد اللاسلكي الموجودة على العمود تواجه AFC، وتحقق من أن الاتصال بين العمود والصمام آمن. ضع أنبوب مخرج النفايات في حاوية تجميع.من شاشة الإعداد، حدد جدول التجميع واضبط العدد على 13 والحجم على 0.5 ملليلتر بالضغط على زري ناقص أو زائد. اترك إعداد وحدة تخزين التخزين المؤقت كإعداد افتراضي ل 2.7 ملليلتر ثم أغلق نافذة جدول التجميع. حدد بدء المجموعة من الشاشة الرئيسية وقم بتأكيد معلمات المجموعة عن طريق تحديد نعم.تحميل 13 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر مع فتح الأغطية والإشارة نحو مركز دائري. تقدم AFC عن طريق تحديد OK ، ثم قم بتركيب خزان العمود والتقدم مرة أخرى عن طريق الضغط على OK. حدد خيار مسح العمود بالضغط على نعم، وأضف وحدة تخزين عمود واحدة بحجم 0.2 ميكرومتر PBS تمت تصفيتها لإزالة أي مخزن مؤقت للتخزين. بمجرد اكتمال التدفق ، تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم عن طريق الضغط على موافق. ضع الغطاء الدوار فوق الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واضغط على موافق. استخدم ماصة لإزالة أي مخزن مؤقت زائد من العمود.أحضر ثلاثة ملليغرام من عينة 100R إلى 500 ميكرولتر باستخدام 1X PBS وأضف العينة إلى أعلى العمود. قم بإعداد حجم عمود واحد من 0.2 ميكرومتر PBS المصفاة. تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واسمح للعينة بالدخول في القلق.بمجرد دخول العينة بالكامل إلى العمود ، أضف PBS المعد مسبقا إلى الخزان. راقب سير عمل الاتحاد الآسيوي لكرة القدم أثناء قيامه أولا بجمع حجم الفراغ ثم الكسور المحددة. بعد اكتمال التشغيل وعودة الدوار إلى وضع النفايات ، قم بإزالة الغطاء وأنابيب الكسر من الدوار.بالنسبة لكسور 0.5 ملم التي تم جمعها من ثلاثة ملليغرامات من 100R Mtb CFP ، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام micro-BCA مع تخفيف 1: 3 للكسور المرقمة من 1 إلى 7 من كل عينة في ثلاثة أضعاف. بالنسبة لكسور 0.5 ملليلتر المرقمة من 5 إلى 13 ، استخدم BCA بدون تخفيف لكل عينة في ثلاثة أضعاف. أضف مخزن عينة SDS إلى 10 ميكرولترات من كل جزء وخمسة ميكروغرامات من CFP و 100R.تغلي لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية. ثم قم بالتحميل على هلام Bis-Tris من 4 إلى 12٪ مع سلم الوزن الجزيئي للرحلان الكهربائي لهلام polyacrylamide ، أو PAGE. قم بتشغيل هلام SDS-PAGE باستخدام مخزن مؤقت يعمل 1X MES وتيار 200 فولت لمدة 35 دقيقة.قم بإزالة الجل من الكاسيت وتطبيق تيار 50 فولت لمدة ساعة واحدة على الأقل لنقل البروتينات التي تم حلها إلى غشاء نيتروسليلوز 0.2 ميكرومتر. أخيرا ، قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتقييم البروتينات. يوضح جل SDS-PAGE الملطخ بالفضة الشكل الكلي للبروتين لكل كسر.تظهر البيانات أن الكسور اللاحقة تحتوي على المزيد من البروتين وتشبه مادة 100R. تظهر البقع الغربية التي تكتشف LAM و LpqH و GroES أن علامة البروتين تتغير عبر الكسور. يظهر هنا المجهر الإلكتروني للإرسال، أو صور TEM، لكسور SEC من 1 إلى 3 التي تم سحبها قبل التثبيت.كان الطرد المركزي المتدرج للكثافة لمركبات Mtb EVs ملطخا سلبا لتصوير TEM. يظهر هنا تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو توزيع NTA ، لكسور SEC من 1 إلى 3. تم تحليل الطرد المركزي الفائق التدرج في الكثافة Mtb EVs باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ويتم عرض توزيع الحجم هنا.تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية EV من ثلاثة ملليغرام من 100R. إذا كان حمل البروتين متنوعا ، فقد يتطلب التخفيف الموصى به واستراتيجية BCA على الكسور الناتجة تعديلا. يمكن استخدام المركبات الكهربائية Mtb المعدة بهذه التقنية للدراسات التركيبية والقائمة على omics في المراحل النهائية.كما أنها مناسبة للتجارب في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه التقنية طريقة سهلة وفعالة لإنتاج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة ، مما يمهد الطريق لزيادة قابلية التكرار في تجارب Mtb EV المستقبلية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

تحضير العينة من<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; العدوى

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...