Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende støtte fra College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award og College Research Council Shared Research Program til NKG og finansiering fra ATCC (pris nr. 2016-0550-0002) til KMD. Vi vil også gerne anerkende Anne Simpson for teknisk support og BEI Resources, NIAID, NIH for følgende reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produceret in vitro), NR-13792, Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produceret in vitro), NR-49223 og Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produceret in vitro), NR-13811.

Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkendte denne undersøgelse (19-046B). Dyrkning af Mycobacterium tuberculosis og høst af EV-rige kultur supernatants blev udført af uddannet personale i et højindeslutningslaboratorium. Materialerne blev flyttet ud af området med høj indeslutning, efter at en gyldig inaktiveringsmetode blev udført, bekræftet og godkendt af institutionelle biosikkerhedspolitikker. Hvis det ikke er muligt at kopiere protokollen, skal følgende procedurer udføres...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er meget antigene reservoirer, som præsenterer dem som en attraktiv vej til udvikling af diagnostiske værktøjer og fremtidige vacciner 4,19,20. Historisk set er densitetsgradient ultracentrifugering blevet brugt til at adskille Mtb-elbiler fra andet opløseligt, udskilt materiale8. Selvom denne proces er effektiv, er den også tidskrævende,...

Ekstracellulær vesikel (EV) frigivelse af patogener kan være nøglen til at låse op for nye teknologier til bekæmpelse af infektionssygdomme1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen med høj konsekvens, der inficerer ca. en tredjedel af verdens befolkning og kræver millioner af menneskers liv hvert år2. Ev-produktion af Mtb er veldokumenteret, men undvigende i biogenesen og forskellige roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern- og næringsstofopsamling) af disse elbiler i forbindelse med infektion 3,4,5. Bestræbelser på at forstå sammensætningen af Mtb-elbiler afslørede 50-150 nm lipidmembran-lukkede kugler afledt af plasmamembranen indeholdende lipider og proteiner af immunologisk betydning 3,6. Undersøgelse af Mtb-elbilers rolle i bakteriel fysiologi har afsløret betydningen af bakteriel EV-modulering som reaktion på miljøbelastning for overlevelse5. Værtspatogen-interaktionsundersøgelser har været mere komplicerede at fortolke, men beviser tyder på, at Mtb-elbiler kan påvirke værtens immunrespons og potentielt kan tjene som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De fleste undersøgelser af Mtb-elbiler hidtil har været afhængige af densitetsgradient ultracentrifugering til vesikelberigelse8. Dette har været effektivt for mindre undersøgelser; Denne teknik har dog flere tekniske og logistiske udfordringer. Alternative arbejdsgange kobler flertrinscentrifugering til fjernelse af hele celler og stort affald med et sidste ultracentrifugeringstrin til pellet-elbiler. Denne metode kan variere i effektivitet og resulterer ofte i lavt udbytte og co-oprensning af opløselige ikke-vesikelassocierede biomolekyler, samtidig med at den påvirker vesikelintegriteten9. Derudover er denne proces tidskrævende, manuelt intensiv og meget begrænset i gennemstrømning på grund af udstyrsbegrænsninger.
Den nuværende protokol beskriver en alternativ teknik til densitetsgradient ultracentrifugering: størrelsesekskluderingskromatografi (SEC). Denne metode er demonstreret for miljømykobakterier, og i det aktuelle arbejde er den ekstrapoleret til Mtb10. En kommercielt tilgængelig søjle- og automatisk brøkopsamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og reducere behovet for specifikt, dyrt udstyr. Det er også muligt at fuldføre denne protokol på en brøkdel af tiden sammenlignet med densitetsgradient ultracentrifugering, hvilket øger gennemstrømningen. Denne teknik er mindre teknisk udfordrende, hvilket gør det lettere at mestre og kan øge reproducerbarheden mellem / intralaboratoriet. Endelig har SEC høj separationseffektivitet og er skånsom og bevarer vesiklernes integritet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Den rolle, som ekstracellulære vesikler (EV'er) spiller i forbindelse med bakteriel infektion, er opstået som en ny vej til forståelse af mikrobiel fysiologi. Specifikt spiller Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbiler en rolle i værtspatogeninteraktionen og reaktionen på miljøstress. Mtb-elbiler er også meget antigene og viser potentiale som vaccinekomponenter. Den mest almindelige metode til rensning af Mtb-elbiler er densitetsgradient ultracentrifugering. Denne proces har flere begrænsninger, herunder lav gennemstrømning, lavt udbytte, afhængighed af dyrt udstyr, tekniske udfordringer, og det kan påvirke den resulterende forberedelse negativt. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) er en blidere alternativ metode, der bekæmper mange af begrænsningerne ved ultracentrifugering. Denne protokol viser, at SEC er effektiv til Mtb EV-berigelse og producerer Mtb EV-præparater af høj kvalitet med øget udbytte på en hurtig og skalerbar måde. Derudover viser en sammenligning med densitetsgradient ultracentrifugering ved kvantificerings- og kvalifikationsprocedurer fordelene ved SEC. Mens evalueringen af EV-mængde (nanopartikelsporingsanalyse), fænotype (transmissionselektronmikroskopi) og indhold (Western blotting) er skræddersyet til Mtb-elbiler, kan den leverede arbejdsgang anvendes på andre mykobakterier.

Kulturfiltratprotein (CFP) fra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) blev koncentreret, kvantificeret, og derefter blev 3 mg materiale påført en størrelsesekskluderende kromatografi (SEC) kolonne. Protein- og partikelkoncentrationerne blev opregnet med henholdsvis BCA og NTA. Forventede intervaller for protein- og partikelgenvinding plus de nøjagtige værdier opnået for disse resultater er rapporteret i tabel 1. Værdier, der er meget højere end disse intervaller, kan indikere problemer med for...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Denne protokol beskriver størrelsesekskluderende kromatografi, en letkøbt og reproducerbar teknik til berigelse af Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler fra kultursupernatanter.

Mycobacterium tuberkulose Ekstracellulær vesikelberigelse gennem størrelsesekskluderingskromatografi

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Denne protokol reducerer den tekniske kompleksitet og tid, der kræves til berigelse af ekstracellulære vesikler fra Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV'er. Det giver et blidt alternativ til traditionelle ultracentrifugering og densitetsbaserede teknikker. Den største fordel ved denne teknik er, at den er let at udføre, hvilket gør den mere reproducerbar.Det giver et højt udbytte af Mtb-elbiler med minimal co-berigelse uden for EV-protein. Demonstrerer proceduren vil være Joanie Ryan, en tidligere kandidatstuderende i vores laboratorium. Til at begynde med skal du forberede et 100 kilodalton molekylvægtsafskæringscentrifugalfilter ved at tilføje PBS's fulde volumenkapacitet.Centrifuge i fem minutter ved 2.800 gange G ved 4 grader Celsius. Gennemstrømningen og eventuelle resterende PBS kasseres, og prøvekammeret fyldes med Mtb CFP til dets maksimale kapacitet. Centrifuge ved 2.800 gange G ved 4 grader Celsius, indtil volumenet er reduceret til ultrafiltreringsanordningens mindste volumen.Gentag efter behov, indtil hele prøven er reduceret tilstrækkeligt. Der tilsættes 1X PBS til filterenheden, der indeholder koncentratet, op til enhedens samlede kapacitet. Reducer lydstyrken som beskrevet før, og gentag dette trin fem gange for at sikre fuldstændig vask og bufferudskiftning.Gendan derefter det 100 kilodalton koncentrerede CFP-retentat eller 100R i henhold til specifikationerne for ultrafiltreringsenheden. Vask filteret med et minimalt volumen på 1X PBS mindst tre gange, og træk vasken med 100R for at maksimere gendannelsen. Brug flere fortyndinger af prøver i PBS og kvantificer 100R-materialet med et bicinchoninisk assay.Prøven testes i tre eksemplarer. Tillad, at størrelsesekskluderingskromatografien eller SEC-kolonnen svarer til stuetemperatur. Tænd for AFC ved hjælp af afbryderen på bagsiden af tårnenheden, og tryk om nødvendigt på Opsætning på hovedmenuens berøringsskærm for at justere indstillingerne for vejecellen.Fra opsætningsskærmen skal du justere karrusellen ved at vælge Karrusel efterfulgt af Kalibrer. Indsæt karrusellen med de 13 små huller opad i AFC-tårnet, og juster karrusellen ved at trykke på minus- eller plusknapperne, så væskedysen er direkte over skyllepositionen. Fjern hætterne fra den ækvilibrerede SEC-kolonne, og skub SEC-kolonnen ind i den relevante kolonnemontering.Installer det omhyggeligt på AFC-tårnet. Sørg for, at radiofrekvensidentifikationskoden på søjlen vender mod AFC, og kontroller, at forbindelsen mellem søjlen og ventilen er sikker. Anbring affaldsudløbsslangen i en opsamlingsbeholder.Fra opsætningsskærmen skal du vælge Indsamlingsplan og indstille antallet til 13 og størrelsen til 0.5 ml ved at trykke på minus- eller plusknapperne. Lad buffervolumenindstillingen være standard på 2,7 ml, og luk derefter vinduet med indsamlingsplanen. Vælg Start samling på startskærmen, og bekræft indsamlingsparametrene ved at vælge Ja.Load 13 mærkede 1,7 milliliter mikrocentrifugerør med lågene åbne og pegende mod karruselcentret. Fremryk AFC ved at vælge OK, monter derefter søjlebeholderen, og gå videre igen ved at trykke på OK. Vælg muligheden for at skylle kolonnen ved at trykke på Ja, og tilføj et kolonnevolumen på 0,2 mikrometer filtreret PBS for at fjerne enhver lagerbuffer. Når skylningen er færdig, skal du fremme AFC ved at trykke på OK. Placer karruseldækslet over AFC'en, og tryk på OK. Brug en pipette til at fjerne overskydende buffer fra søjlen.Bring tre milligram 100R prøve til 500 mikroliter med 1X PBS og tilsæt prøven til toppen af kolonnen. Forbered et kolonnevolumen på 0,2 mikrometer filtreret PBS. Fremryk AFC, og lad prøven løbe ind i ærgrelsen.Når prøven er kommet helt ind i kolonnen, tilsættes den PBS, der er forberedt tidligere, til reservoiret. Overvåg kørslen af AFC, mens den først samler tomrumsvolumenet og derefter de angivne fraktioner. Når kørslen er afsluttet, og karrusellen vender tilbage til affaldspositionen, skal du fjerne dækslet og fraktionsrørene fra karrusellen.For 0,5 millimeter fraktioner indsamlet fra tre milligram 100R Mtb CFP måles proteinkoncentrationen ved hjælp af mikro-BCA med en 1: 3 fortynding for fraktioner nummereret 1 til 7 af hver prøve i tre eksemplarer. For 0,5 ml fraktioner nummereret 5 til 13 anvendes BCA uden fortynding for hver prøve i tre eksemplarer. Tilsæt SDS-prøvebuffer til 10 mikroliter af hver fraktion og fem mikrogram CFP og 100R.Kog i fem minutter ved 100 grader Celsius. Læg derefter på en 4 til 12% Bis-Tris gel med en molekylvægtstige til polyacrylamid gelelektroforese eller PAGE. Kør en SDS-PAGE gel ved hjælp af 1X MES løbebuffer og en 200 volt strøm i 35 minutter.Fjern gelen fra kassetten, og påfør en 50 volt strøm i mindst en time for at overføre de opløste proteiner til en 0,2 mikrometer nitrocellulosemembran. Til sidst skal du udføre Western blot-analysen for at evaluere proteinerne. En SDS-PAGE gel farvet med sølv demonstrerer den samlede proteinprofil for hver fraktion.Dataene viser, at de senere fraktioner indeholder mere protein og ligner 100R-materialet. Western blots, der registrerer LAM, LpqH og GroES, viser, at proteinmarkøren ændrer sig på tværs af fraktionerne. Transmissionselektronmikroskopi eller TEM-billeder af SEC-fraktioner 1 til 3 trukket før fiksering vises her.Tæthedsgradienten ultracentrifugering af Mtb-elbiler blev negativt farvet til TEM-billeddannelse. Nanopartikelsporingsanalysen eller NTA-fordelingen af SEC-fraktion 1 til 3 er vist her. Tæthedsgradienten ultracentrifugering Mtb EV'er blev analyseret med nanopartikelsporingsanalyse, og størrelsesfordelingen vises her.Denne protokol er optimeret til EV-rensning fra tre milligram 100R. Hvis proteinbelastningen er varieret, kan den anbefalede fortyndings- og BCA-strategi for resulterende fraktioner kræve justering. Mtb-elbiler fremstillet med denne teknik kan bruges til nedstrøms kompositions- og omics-baserede undersøgelser.De er også velegnede til in vitro- og in vivo-eksperimenter. Denne teknik giver en letkøbt og effektiv måde at producere Mtb EV-præparater af høj kvalitet, hvilket baner vejen for øget reproducerbarhed i fremtidige Mtb EV-eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentel model til at studere tuberkulose-Malaria coinfektion på Natural Transmission af Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstration af en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Forstærkning Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel microdissection tilgang til Recovering<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Specifikke Udskrifter fra Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomer

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig Lung Tissue Model for Funktionelle Undersøgelser om<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System til Effekt og cytotoksicitet Screening af inhibitorer Målretning Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

En High-throughput Kompatibel Assay at evaluere Drug Effekt mod makrofag passeres<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberkulose i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluering af ekstracellulære vesikel funktion under Malaria infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...