Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
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Nous aimerions remercier le college of veterinary medicine and biomedical sciences Experiential Award et le College Research Council Shared Research Program à NKG et le financement de l’ATCC (prix # 2016-0550-0002) à KMD. Nous tenons également à remercier Anne Simpson pour son soutien technique et BEI Resources, NIAID, NIH pour les réactifs suivants : Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produit in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produit in vitro), NR-49223, et Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produit in vitro), NR-13811.

Le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université d’État du Colorado a approuvé la présente étude (19-046B). La culture de Mycobacterium tuberculosis et la récolte de surnageants de culture riches en EV ont été effectuées par du personnel qualifié dans un laboratoire à haut confinement. Les matériaux ont été déplacés hors de la zone de confinement élevé après qu’une méthode d’inactivation valide a été effectuée, confirmée et approuvée par les politiques de biosécurité ...

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	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis sont des réservoirs hautement antigéniques, ce qui les présente comme une avenue attrayante pour le développement d’outils de diagnostic et de futurs vaccins 4,19,20. Historiquement, l’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour séparer les VÉHICULES VTT d’autres matériaux solubles et sécrétés8. ...

La libération de vésicules extracellulaires (VE) par des agents pathogènes peut être la clé pour déverrouiller de nouvelles technologies pour contrôler les maladies infectieuses1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un agent pathogène de grande importance, infectant environ un tiers de la population mondiale et coûtant la vie à des millions de personnes chaque année2. La production de VE par Mtb est bien documentée mais insaisissable dans la biogenèse et les rôles variés (c.-à-d. immunostimulant, immunosuppresseur, acquisition de fer et de nutriments) de ces VE dans le contexte de l’infection 3,4,5. Les efforts pour comprendre la composition des VE Mtb ont révélé des sphères enveloppées de membrane lipidique de 50 à 150 nm dérivées de la membrane plasmique contenant des lipides et des protéines d’importance immunologique 3,6. L’étude du rôle des VE VTT dans la physiologie bactérienne a révélé l’importance de la modulation bactérienne ev en réponse au stress environnemental pour la survie5. Les études d’interaction hôte-pathogène ont été plus compliquées à interpréter, mais les preuves indiquent que les VE MTB peuvent influencer la réponse immunitaire de l’hôte et peuvent potentiellement servir de composante vaccinale efficace 3,4,7.
Jusqu’à présent, la plupart des études sur les véhicules électriques VTT se sont appuyées sur l’ultracentrifugation par gradient de densité pour l’enrichissement des vésicules8. Cela a été efficace pour les études à petite échelle; cependant, cette technique présente plusieurs défis techniques et logistiques. Des flux de travail alternatifs associent la centrifugation en plusieurs étapes, pour l’élimination des cellules entières et des gros débris, à une étape finale d’ultracentrifugation pour pelleter les véhicules électriques. Cette méthodologie peut varier en efficacité et entraîne souvent un faible rendement et une co-purification des biomolécules solubles non associées aux vésicules tout en ayant un impact sur l’intégrité des vésicules9. De plus, ce processus prend beaucoup de temps, est manuel et son débit est très limité en raison des contraintes de l’équipement.
Le présent protocole décrit une technique alternative à l’ultracentrifugation par gradient de densité : la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Cette méthode a été démontrée pour les mycobactéries environnementales, et dans les travaux actuels, elle a été extrapolée à Mtb10. Une colonne disponible dans le commerce et un collecteur de fraction automatique peuvent améliorer la cohérence de la préparation vésicale et réduire la nécessité d’un équipement spécifique et coûteux. Il est également possible de compléter ce protocole en une fraction du temps par rapport à l’ultracentrifugation à gradient de densité, ce qui augmente le débit. Cette technique est moins difficile techniquement, ce qui la rend plus facile à maîtriser, et peut augmenter la reproductibilité inter/intra-laboratoire. Enfin, le SEC a une efficacité de séparation élevée et est doux, préservant l’intégrité des vésicules.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans le contexte de l’infection bactérienne est apparu comme une nouvelle voie pour comprendre la physiologie microbienne. Plus précisément, les VE de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jouent un rôle dans l’interaction hôte-pathogène et la réponse au stress environnemental. Les VE MTB sont également très antigéniques et présentent un potentiel en tant que composants du vaccin. La méthode la plus courante pour purifier les véhicules électriques vtt est l’ultracentrifugation par gradient de densité. Ce processus présente plusieurs limites, notamment un faible débit, un faible rendement, une dépendance à l’égard d’équipements coûteux, des défis techniques et peut avoir un impact négatif sur la préparation qui en résulte. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) est une méthode alternative plus douce qui combat bon nombre des limites de l’ultracentrifugation. Ce protocole démontre que SEC est efficace pour l’enrichissement des vtt EV et produit des préparations Mtb EV de haute qualité avec un rendement accru de manière rapide et évolutive. De plus, une comparaison avec l’ultracentrifugation du gradient de densité par des procédures de quantification et de qualification démontre les avantages de la SEC. Bien que l’évaluation de la quantité de VE (analyse de suivi des nanoparticules), du phénotype (microscopie électronique à transmission) et du contenu (Transfert western) soit adaptée aux véhicules électriques vtt, le flux de travail fourni peut être appliqué à d’autres mycobactéries.

La protéine de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été concentrée, quantifiée, puis 3 mg de matériau ont été appliqués sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Les concentrations de protéines et de particules ont été dénombrées par BCA et NTA, respectivement. Les fourchettes attendues pour la récupération des protéines et des particules ainsi que les valeurs exactes obtenues pour ces résultats sont indiquées dans le tableau 1...

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Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Ce protocole décrit la chromatographie d’exclusion de taille, une technique facile et reproductible pour enrichir les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis à partir de surnageants de culture.

Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Ce protocole réduit la complexité technique et le temps nécessaire à l’enrichissement des vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Il offre une alternative douce aux techniques traditionnelles d’ultracentrifugation et de densité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser, ce qui la rend plus reproductible.Il fournit un rendement élevé de VE Mtb avec un co-enrichissement minimal des protéines non-EV. La démonstration de la procédure sera assurée par Joanie Ryan, une ancienne étudiante diplômée de notre laboratoire. Pour commencer, préparez un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons en ajoutant la pleine capacité volumique du PBS.Centrifuger pendant cinq minutes à 2 800 fois G à 4 degrés Celsius. Jetez le PBS restant et remplissez la chambre d’échantillonnage avec du Mtb CFP jusqu’à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 fois G à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimum du dispositif d’ultrafiltration.Répéter si nécessaire jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit. Ajoutez 1X PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit précédemment et répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage complet et un échange tampon.Ensuite, récupérez le rétentat concentré de CFP de 100 kilodaltons ou 100R, selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration. Lavez le filtre avec un volume minimal de 1X PBS au moins trois fois et tirez le lavage avec le 100R pour maximiser la récupération. Utiliser plusieurs échantillons de dilution dans du PBS et quantifier le matériau 100R avec un dosage bicinchoninique.Testez l’échantillon en trois exemplaires. Laisser la chromatographie d’exclusion de taille, ou colonne SEC, s’équilibrer à température ambiante. Allumez l’AFC à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de la tour et appuyez sur Configuration sur l’écran tactile du menu principal si nécessaire pour ajuster les paramètres de la cellule de charge.Dans l’écran de configuration, alignez le carrousel en sélectionnant Carrousel puis Calibrer. Insérez le carrousel avec les 13 petits trous vers le haut dans la tour AFC et ajustez le carrousel en appuyant sur les boutons moins ou plus de sorte que la buse de fluide soit directement au-dessus de la position de chasse d’eau. Retirez les capuchons de la colonne SEC équilibrée et faites glisser la colonne SEC dans le support de colonne approprié.Installez-le soigneusement sur la tour AFC. Assurez-vous que l’étiquette d’identification par radiofréquence sur la colonne fait face à l’AFC et vérifiez que la connexion entre la colonne et la vanne est sécurisée. Placez le tuyau de sortie des déchets dans un récipient de collecte.Dans l’écran de configuration, sélectionnez Calendrier de collecte et réglez le nombre sur 13 et la taille sur 0,5 millilitre en appuyant sur les boutons moins ou plus. Conservez le paramètre de volume de mémoire tampon par défaut de 2,7 millilitres, puis fermez la fenêtre de planification de collecte. Sélectionnez Démarrer la collecte dans l’écran d’accueil et confirmez les paramètres de collecte en sélectionnant Oui.Chargez 13 tubes microcentrifugeuses étiquetés de 1,7 millilitre avec les couvercles ouverts et pointant vers le centre du carrousel. Avancez l’AFC en sélectionnant OK, puis montez le réservoir de colonne et avancez à nouveau en appuyant sur OK. Sélectionnez l’option permettant de vider la colonne en appuyant sur Oui et ajoutez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 micromètre pour supprimer tout tampon de stockage. Une fois le rinçage terminé, avancez l’AFC en appuyant sur OK. Placez le couvercle du carrousel sur l’AFC et appuyez sur OK. Utilisez une pipette pour éliminer tout excès de tampon de la colonne.Apportez trois milligrammes d’échantillon 100R à 500 microlitres avec 1X PBS et ajoutez l’échantillon en haut de la colonne. Préparez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 micromètre. Avancez l’AFC et laissez l’échantillon s’écouler dans la frette.Une fois que l’échantillon est complètement entré dans la colonne, ajouter le PBS préparé précédemment dans le réservoir. Surveillez l’exécution de l’AFC pendant qu’il collecte d’abord le volume vide, puis les fractions spécifiées. Une fois l’exécution terminée et le carrousel remis en position de déchets, retirez le couvercle et les tubes de fraction du carrousel.Pour les fractions de 0,5 millimètre prélevées à partir de trois milligrammes de CFP 100R Mtb, mesurer la concentration en protéines à l’aide du micro-BCA avec une dilution de 1:3 pour les fractions numérotées de 1 à 7 de chaque échantillon en trois exemplaires. Pour les fractions de 0,5 millilitre numérotées de 5 à 13, utiliser le BCA sans dilution pour chaque échantillon en trois exemplaires. Ajouter un tampon d’échantillon SDS à 10 microlitres de chaque fraction et cinq microgrammes de CFP et 100R.Faire bouillir pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius. Chargez ensuite sur un gel Bis-Tris à 4 à 12% avec une échelle de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, ou PAGE. Exécutez un gel SDS-PAGE en utilisant un tampon de fonctionnement MES 1X et un courant de 200 volts pendant 35 minutes.Retirez le gel de la cassette et appliquez un courant de 50 volts pendant au moins une heure pour transférer les protéines résolues sur une membrane de nitrocellulose de 0,2 micromètre. Enfin, effectuez l’analyse par transfert Western pour évaluer les protéines. Un gel SDS-PAGE coloré à l’argent démontre le profil protéique global de chaque fraction.Les données montrent que les fractions ultérieures contiennent plus de protéines et ressemblent au matériau 100R. Les transferts Western détectant LAM, LpqH et GroES démontrent que les marqueurs protéiques changent d’une fraction à l’autre. La microscopie électronique à transmission, ou images MET, des fractions SEC 1 à 3 tirées avant la fixation est montrée ici.L’ultracentrifugation à gradient de densité des véhicules électriques à vtt a été négativement colorée pour l’imagerie TEM. L’analyse de suivi des nanoparticules, ou distribution NTA, des fractions SEC 1 à 3 est illustrée ici. Les EV Mtb à ultracentrifugation à gradient de densité ont été analysés avec une analyse de suivi des nanoparticules, et la distribution de taille est affichée ici.Ce protocole a été optimisé pour la purification EV à partir de trois milligrammes de 100R. Si la charge protéique est variable, la dilution recommandée et la stratégie de BCA sur les fractions résultantes peuvent nécessiter un ajustement. Les VE MTB préparés avec cette technique peuvent être utilisés pour des études de composition en aval et des études omiques.Ils conviennent également aux expériences in vitro et in vivo. Cette technique fournit un moyen facile et efficace de produire des préparations de VTT EV de haute qualité, ouvrant la voie à une reproductibilité accrue dans les futures expériences de Mtb EV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification de puces à ADN

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Une nouvelle approche microdissection de la récupération<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Transcriptions spécifiques de formol paraffine fixe embarqué poumon granulomes

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...