Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Wir möchten uns für die Unterstützung des College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award und des College Research Council Shared Research Program für NKG und die Finanzierung durch ATCC (Award # 2016-0550-0002) für KMD bedanken. Wir möchten auch Anne Simpson für die technische Unterstützung und BEI Resources, NIAID, NIH für die folgenden Reagenzien danken: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produziert in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produziert in vitro), NR-49223 und Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produziert in vitro), NR-13811.

Das Institutional Biosafety Committee der Colorado State University genehmigte die vorliegende Studie (19-046B). Die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis und die Ernte von EV-reichen Kulturüberständen wurden von geschultem Personal in einem High-Containment-Labor durchgeführt. Die Materialien wurden aus dem High-Containment-Bereich entfernt, nachdem eine gültige Inaktivierungsmethode durchgeführt, bestätigt und durch institutionelle Biosicherheitsrichtlinien genehmigt wurde. Während der Replikation...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffendarstellen 4,19,20. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Materialzu trennen 8. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er au...

Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheitensein 1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert2. Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion 3,4,5. Bemühungen, die Zusammensetzung von Mtb-EVs zu verstehen, zeigten 50-150 nm Lipidmembran-umschlossene Kugeln, die aus der Plasmamembran stammen, die Lipide und Proteine von immunologischer Bedeutung enthält 3,6. Die Untersuchung der Rolle von Mtb-EVs in der bakteriellen Physiologie hat die Bedeutung der bakteriellen EV-Modulation als Reaktion auf Umweltstress für das Überlebengezeigt 5. Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien waren komplizierter zu interpretieren, aber es gibt Hinweise darauf, dass Mtb-EVs die Immunantwort des Wirts beeinflussen können und möglicherweise als wirksame Impfkomponentedienen können 3,4,7.
Die meisten Studien an Mtb-EVs haben sich bisher auf die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für die Vesikelanreicherungverlassen 8. Dies hat sich für kleine Studien als wirksam erwiesen; Diese Technik hat jedoch mehrere technische und logistische Herausforderungen. Alternative Workflows koppeln die mehrstufige Zentrifugation zur Entfernung ganzer Zellen und großer Ablagerungen mit einem abschließenden Ultrazentrifugationsschritt zur Pelletierung von Elektrofahrzeugen. Diese Methodik kann in ihrer Effizienz variieren und führt oft zu einer geringen Ausbeute und Mitreinigung löslicher nicht-vesikelassoziierter Biomoleküle und beeinflusst gleichzeitig die Vesikelintegrität9. Darüber hinaus ist dieser Prozess zeitaufwändig, manuell intensiv und aufgrund von Gerätebeschränkungen sehr begrenzt im Durchsatz.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine alternative Technik zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation: die Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Methode wurde für Umweltmykobakterien demonstriert und in der aktuellen Arbeit auf Mtb10 extrapoliert. Eine handelsübliche Säule und ein automatischer Fraktionssammler können die Konsistenz bei der vesikalen Vorbereitung verbessern und die Notwendigkeit für spezifische, teure Geräte reduzieren. Es ist auch möglich, dieses Protokoll in einem Bruchteil der Zeit im Vergleich zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation abzuschließen, wodurch der Durchsatz erhöht wird. Diese Technik ist technisch weniger anspruchsvoll, was die Beherrschung erleichtert und die Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Labors erhöhen kann. Schließlich hat SEC eine hohe Abscheideeffizienz und ist schonend, wobei die Integrität der Vesikel erhalten bleibt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.

Kulturfiltratprotein (CFP) aus Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde konzentriert, quantifiziert und dann 3 mg Material auf eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) aufgetragen. Die Protein- und Partikelkonzentrationen wurden von BCA bzw. NTA aufgezählt. Die erwarteten Bereiche für die Protein- und Partikelrückgewinnung sowie die genauen Werte, die für diese Ergebnisse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Werte, die viel höher als diese Bereiche sind, können auf Verunrei...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.

Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Dieses Protokoll reduziert die technische Komplexität und den Zeitaufwand für die Anreicherung extrazellulärer Vesikel aus Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Es bietet eine sanfte Alternative zu herkömmlichen Ultrazentrifugations- und dichtebasierten Techniken. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach durchzuführen ist, wodurch sie reproduzierbarer wird.Es bietet eine hohe Ausbeute an Mtb-EVs mit minimaler Nicht-EV-Protein-Co-Anreicherung. Joanie Ryan, eine ehemalige Doktorandin unseres Labors, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, bereiten Sie einen 100-Kilodaltonnen-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalfilter vor, indem Sie die volle Volumenkapazität von PBS hinzufügen.Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 2.800 mal G bei 4 Grad Celsius. Verwerfen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS und füllen Sie die Probenkammer mit Mtb CFP bis zu ihrer maximalen Kapazität. Zentrifugieren Sie bei 2.800 mal G bei 4 Grad Celsius, bis das Volumen auf das Mindestvolumen der Ultrafiltrationsvorrichtung reduziert ist.Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde. Fügen Sie der Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, 1X PBS bis zur Gesamtgerätekapazität hinzu. Reduzieren Sie das Volumen wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Wäsche und einen Pufferaustausch zu gewährleisten.Gewinnen Sie dann das 100-Kilodalton-konzentrierte CFP-Retentat oder 100R gemäß den Spezifikationen der Ultrafiltrationsvorrichtung. Waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem minimalen Volumen von 1X PBS und ziehen Sie die Wäsche mit dem 100R, um die Rückgewinnung zu maximieren. Verwenden Sie mehrere Verdünnungen von Proben in PBS und quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay.Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung. Lassen Sie die Größenausschlusschromatographie oder SEC-Spalte an die Raumtemperatur angleichen. Schalten Sie den AFC über den Netzschalter auf der Rückseite der Tower-Einheit ein und drücken Sie bei Bedarf auf dem Touchscreen des Hauptmenüs auf Setup, um die Einstellungen für die Wägezelle anzupassen.Richten Sie das Karussell auf dem Setup-Bildschirm aus, indem Sie Karussell und anschließend Kalibrieren auswählen. Stecken Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm und stellen Sie das Karussell durch Drücken der Minus- oder Plus-Tasten so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der Spülposition befindet. Entfernen Sie die Kappen aus der ausgeglichenen SEC-Säule, und schieben Sie die SEC-Spalte in die entsprechende Säulenhalterung.Installieren Sie es vorsichtig auf dem AFC-Turm. Stellen Sie sicher, dass das Funkfrequenz-Identifikationsetikett an der Säule dem AFC zugewandt ist, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Abfallauslassschlauch in einen Auffangbehälter.Wählen Sie im Setup-Bildschirm Sammlungszeitplan und stellen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 Milliliter ein, indem Sie die Minus- oder Plus-Tasten drücken. Behalten Sie die Einstellung für das Puffervolumen als Standardeinstellung von 2,7 Milliliter bei, und schließen Sie dann das Fenster mit dem Erfassungszeitplan. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Sammlung starten aus, und bestätigen Sie die Sammlungsparameter, indem Sie Ja auswählen.Laden Sie 13 beschriftete 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffnetem Deckel und zeigen Sie in Richtung Karussellmitte. Verschieben Sie den AFC, indem Sie OK auswählen, montieren Sie dann den Säulenbehälter und fahren Sie wieder fort, indem Sie OK drücken. Wählen Sie die Option zum Leeren der Säule aus, indem Sie Ja drücken, und fügen Sie ein Spaltenvolumen mit 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS hinzu, um den Speicherpuffer zu entfernen. Sobald der Flush abgeschlossen ist, schieben Sie den AFC voran, indem Sie OK drücken. Legen Sie die Karussellabdeckung über den AFC und drücken Sie OK. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer aus der Säule zu entfernen.Bringen Sie drei Milligramm 100R-Probe mit 1X PBS auf 500 Mikroliter und fügen Sie die Probe oben in die Spalte ein. Bereiten Sie ein Säulenvolumen von 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS vor. Schieben Sie den AFC vor, und lassen Sie die Probe in den Bund laufen.Sobald die Probe vollständig in die Säule gelangt ist, fügen Sie das zuvor vorbereitete PBS in das Reservoir ein. Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Hohlraumvolumen und dann die angegebenen Brüche sammelt. Nachdem der Lauf beendet ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und die Fraktionsröhrchen aus dem Karussell.Für 0,5-Millimeter-Fraktionen, die aus drei Milligramm 100R Mtb CFP gesammelt wurden, messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Mikro-BCA mit einer 1:3-Verdünnung für Fraktionen mit den Nummern 1 bis 7 jeder Probe in dreifacher Ausfertigung. Für 0,5-Milliliter-Fraktionen mit den Nummern 5 bis 13 verwenden Sie den BCA ohne Verdünnung für jede Probe in dreifacher Ausfertigung. Fügen Sie SDS-Probenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Fraktion und fünf Mikrogramm CFP und 100R hinzu.Fünf Minuten bei 100 Grad Celsius kochen. Laden Sie dann ein 4 bis 12% Bis-Tris-Gel mit einer Molekulargewichtsleiter für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder PAGE auf. Lassen Sie ein SDS-PAGE Gel mit 1X MES Laufpuffer und einem 200-Volt-Strom für 35 Minuten laufen.Entfernen Sie das Gel von der Kassette und wenden Sie mindestens eine Stunde lang einen 50-Volt-Strom an, um die aufgelösten Proteine auf eine 0,2-Mikrometer-Nitrozellulosemembran zu übertragen. Führen Sie schließlich die Western-Blot-Analyse durch, um die Proteine zu bewerten. Ein mit Silber gefärbtes SDS-PAGE Gel zeigt das Gesamtproteinprofil für jede Fraktion.Die Daten zeigen, dass die späteren Fraktionen mehr Protein enthalten und dem 100R-Material ähneln. Western Blots zum Nachweis von LAM, LpqH und GroES zeigen, dass sich der Proteinmarker über die Fraktionen hinweg ändert. Transmissionselektronenmikroskopie oder TEM-Bilder von SEC-Fraktionen 1 bis 3, die vor der Fixierung gezogen wurden, sind hier gezeigt.Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von Mtb-EVs wurde für die TEM-Bildgebung negativ angefärbt. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse oder NTA-Verteilung der SEC-Fraktionen 1 bis 3 ist hier dargestellt. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugations-Mtb-EVs wurden mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse analysiert, und die Größenverteilung wird hier angezeigt.Dieses Protokoll wurde für die EV-Reinigung von drei Milligramm 100R optimiert. Wenn die Proteinbelastung variiert wird, müssen die empfohlene Verdünnungs- und BCA-Strategie für die resultierenden Fraktionen möglicherweise angepasst werden. Mit dieser Technik hergestellte MTB-EVs können für nachgeschaltete Zusammensetzungs- und Omics-basierte Studien verwendet werden.Sie eignen sich auch für in vitro und in vivo Experimente. Diese Technik bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, qualitativ hochwertige Mtb-EV-Präparate herzustellen und ebnet den Weg für eine erhöhte Reproduzierbarkeit in zukünftigen Mtb-EV-Experimenten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...