Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

ברצוננו להודות על תמיכת המכללה לרפואה וטרינרית ומדעים ביו-רפואיים פרס חווייתי ותוכנית מחקר משותפת של מועצת המחקר של המכללה ל- NKG ומימון על ידי ATCC (פרס # 2016-0550-0002) ל- KMD. אנו רוצים גם להודות לאן סימפסון על תמיכה טכנית ומשאבי BEI, NIAID, NIH עבור הריאגנטים הבאים: שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LpqH (גן Rv3763), IT-54 (מיוצר במבחנה), NR-13792, שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום GroES (גן Rv3418c), שיבוט IT-3 (SA-12) (מיוצר במבחנה), NR-49223, ושחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LAM, שיבוט CS-35 (מיוצר במבחנה), NR-13811.

הוועדה לביו-בטיחות מוסדית של אוניברסיטת מדינת קולורדו אישרה את המחקר הנוכחי (19-046B). טיפוח שחפת מיקובקטריום וקצירת סופרנאטים עשירים ב-EV בוצעו על ידי צוות מיומן במעבדה להכלה גבוהה. החומרים הועברו אל מחוץ לאזור ההכלה הגבוהה לאחר ששיטת השבתה תקפה בוצעה, אושרה ואושרה על ידי מדיניות הבטיחו?...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריום שחפת הן מאגרים אנטיגניים מאוד, המציגים אותן כאפיק אטרקטיבי לפיתוח כלי אבחון וחיסונים עתידיים 4,19,20. מבחינה היסטורית, אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות שימשה להפרדת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מחומרים מסיס...

שחרור שלפוחית חוץ-תאית (EV) על ידי פתוגנים עשוי להיות המפתח לפתיחת טכנולוגיות חדשות לשליטה במחלות זיהומיות1. מיקובקטריום שחפת (Mtb) הוא פתוגן בעל השלכות גבוהות, מדביק כשליש מאוכלוסיית העולם וגובה את חייהם של מיליוני אנשים בכל שנה2. ייצור EV על ידי Mtb מתועד היטב ועם זאת חמקמק בביוגנזה ובתפקידים המגוונים (כלומר, אימונוסטימולטוריים, מדכאי חיסון, ברזל ורכישת חומרים מזינים) של כלי רכב חשמליים אלה בהקשר של זיהום 3,4,5. מאמצים להבין את הרכבם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb חשפו כדורים סגורים של 50-150 ננומטר של ממברנת השומנים הנגזרים מממברנת הפלזמה המכילים שומנים וחלבונים בעלי משמעות אימונולוגית 3,6. חקירת תפקידם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb בפיזיולוגיה של חיידקים גילתה את החשיבות של אפנון ר"ח חיידקי בתגובה ללחץ סביבתי להישרדות5. מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגנים היו מסובכים יותר לפענוח, אך הראיות מצביעות על כך שרכבים חשמליים מסוג Mtb יכולים להשפיע על התגובה החיסונית של המארח ועשויים לשמש כמרכיב חיסון יעיל 3,4,7.
רוב המחקרים על כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עד כה הסתמכו על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות להעשרת שלפוחית8. זה היה יעיל למחקרים בקנה מידה קטן; עם זאת, לטכניקה זו יש מספר אתגרים טכניים ולוגיסטיים. זרימות עבודה חלופיות מצמידות צנטריפוגה מרובת שלבים, להסרת תאים שלמים ופסולת גדולה, עם שלב אולטרה-צנטריפוגציה סופי לרכבים חשמליים כדוריים. מתודולוגיה זו יכולה להשתנות ביעילותה, ולעתים קרובות גורמת לתפוקה נמוכה ולטיהור משותף של ביו-מולקולות מסיסות שאינן קשורות לשלפוחית, תוך השפעה על שלמותהשלפוחית 9. בנוסף, תהליך זה גוזל זמן רב, אינטנסיבי באופן ידני ומוגבל מאוד בתפוקה בשל אילוצי ציוד.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חלופית ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות: כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). שיטה זו הוכחה עבור מיקובקטריה סביבתית, ובעבודה הנוכחית, היא עברה אקסטרפולציה ל- Mtb10. עמודה זמינה מסחרית ואספן שברים אוטומטי יכולים לשפר את העקביות בהכנת שלפוחית ולהפחית את הצורך בציוד ספציפי ויקר. ניתן גם להשלים פרוטוקול זה בשבריר מהזמן בהשוואה לאולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמגדיל את התפוקה. טכניקה זו פחות מאתגרת מבחינה טכנית, מה שמקל על השליטה בה, ויכולה להגביר את יכולת השכפול הבין-מעבדתית. לבסוף, ל-SEC יש יעילות הפרדה גבוהה והיא עדינה, תוך שמירה על שלמות הבועיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בהקשר של זיהום חיידקי התגלה כאפיק חדש להבנת הפיזיולוגיה המיקרוביאלית. באופן ספציפי, כלי רכב חשמליים של Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ממלאים תפקיד באינטראקציה בין מארח לפתוגן ובתגובה ללחץ סביבתי. כלי רכב חשמליים מסוג Mtb הם גם אנטיגניים מאוד ומראים פוטנציאל כמרכיבי חיסון. השיטה הנפוצה ביותר לטיהור רכבים חשמליים מסוג Mtb היא אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות. לתהליך זה יש מספר מגבלות, כולל תפוקה נמוכה, תפוקה נמוכה, הסתמכות על ציוד יקר, אתגרים טכניים, והוא יכול להשפיע לרעה על ההכנה המתקבלת. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) היא שיטה חלופית עדינה יותר הנלחמת ברבות מהמגבלות של אולטרה-צנטריפוגציה. פרוטוקול זה מדגים כי SEC יעיל להעשרת Mtb EV ומייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה של תפוקה מוגברת באופן מהיר ומדרגי. בנוסף, השוואה ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות על ידי כימות והליכי הסמכה מדגימה את היתרונות של SEC. בעוד שההערכה של כמות EV (ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים), פנוטיפ (מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה) ותוכן (כתם מערבי) מותאמת לרכבים חשמליים מסוג Mtb, ניתן ליישם את זרימת העבודה המסופקת על מיקובקטריות אחרות.

חלבון ניעול תרבית (CFP) מ-Mycobacterium tuberculosis (Mtb) היה מרוכז, כומת, ולאחר מכן הוחלו 3 מ"ג של חומר על עמודת כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). ריכוזי החלבון והחלקיקים נמנו על ידי BCA ו-NTA, בהתאמה. הטווחים הצפויים להתאוששות חלבונים וחלקיקים בתוספת הערכים המדויקים שהתקבלו עבור תוצאות אלה מדווחים בטב...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

פרוטוקול זה מפחית את המורכבות הטכנית ואת הזמן הנדרשים להעשרת שלפוחיות חוץ-תאיות משחפת Mycobacterium, Mtb EVs. הוא מספק אלטרנטיבה עדינה לטכניקות מסורתיות מבוססות אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי קל לבצע, מה שהופך אותו יותר לשכפל.הוא מספק תפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עם העשרה משותפת מינימלית של חלבונים שאינם EV. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ואני ראיין, סטודנטית לשעבר לתואר שני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכן מסנן צנטריפוגלי בעל משקל מולקולרי של 100 קילודלטון על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של PBS.צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס. בטל את הזרימה ואת כל ה- PBS הנותר, ומלא את תא הדגימה ב- Mtb CFP עד לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס עד נפח מופחת לנפח המינימלי של מכשיר אולטרה סינון.יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד שהדגימה כולה צומצמה במידה מספקת. הוסף 1X PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת המכשיר הכוללת. הפחיתו את עוצמת הקול כפי שתואר קודם לכן וחזרו על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת מאגרים.לאחר מכן, לשחזר את 100 קילו קילודלטון מרוכז CFP retentate או 100R, על פי מפרט מכשיר ultrafiltration. שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1X PBS לפחות שלוש פעמים, ומשכו את הכביסה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות. השתמש במספר דילול של דגימות ב- PBS וכמות החומר 100R עם בדיקה bicinchoninic.בדוק את המדגם במשולש. אפשר לכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל, או עמודת ה-SEC, להתאזן לטמפרטורת החדר. הפעל את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בגב יחידת המגדל ולחץ על Setup במסך המגע של התפריט הראשי במידת הצורך כדי להתאים את ההגדרות עבור תא הטעינה.ממסך ההתקנה, יישר את הקרוסלה על-ידי בחירת קרוסלה ואחריה כיול. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה לתוך מגדל AFC וכוונן את הקרוסלה על ידי לחיצה על כפתורי המינוס או הפלוס כך שהזרבובית הנוזלית תהיה ישירות מעל מיקום הסומק. הסר את האותיות הקטנות מעמודת ה- SEC המאוזנת והחלק את עמודת ה- SEC לתוך תושבת העמודה המתאימה.התקן אותו בזהירות על מגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו בעמודה פונה ל-AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. הניחו את צינורות שקע הפסולת במיכל איסוף.ממסך ההתקנה, בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מיליליטר על ידי לחיצה על לחצני המינוס או הפלוס. השאר את הגדרת עוצמת הקול של המאגר כברירת המחדל של 2.7 מיליליטר ולאחר מכן סגור את חלון לוח הזמנים לאיסוף. בחר התחל איסוף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה באפשרות כן.טען 13 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר עם המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה. קדם את AFC על-ידי בחירה באפשרות אישור, ולאחר מכן טען את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לרוקן את העמודה על-ידי הקשה על כן, והוסף נפח עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת הסומק, קדם את ה- AFC על ידי לחיצה על OK. הנח את כיסוי הקרוסלה מעל AFC ולחץ על OK. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף מהעמודה.הביאו שלושה מיליגרם של דגימת 100R ל-500 מיקרוליטרים עם 1X PBS והוסיפו את הדגימה לראש העמודה. הכן נפח עמודה אחת של PBS מסונן 0.2 מיקרומטר. קדם את ה- AFC ואפשר לדגימה לרוץ לתוך הדאגה.לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את ה- PBS שהוכן קודם לכן למאגר. עקוב אחר ההפעלה של AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את אמצעי האחסון הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר שהריצה מסתיימת והקרוסלה חוזרת למצב הפסולת, הסר את הכיסוי ואת צינורות השבר מהקרוסלה.עבור שברים של 0.5 מילימטרים שנאספו משלושה מיליגרם של 100R Mtb CFP, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות מיקרו-BCA עם דילול של 1:3 עבור שברים הממוספרים 1 עד 7 מכל דגימה במשולש. עבור שברים של 0.5 מיליליטר הממוספרים 5 עד 13, השתמש ב- BCA ללא דילול עבור כל דגימה במשולש. הוסף מאגר דגימת SDS ל-10 מיקרוליטרים מכל שבר וחמישה מיקרוגרם של CFP ו-100R.מרתיחים במשך חמש דקות ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען על ג'ל 4 עד 12% Bis-Tris עם סולם משקל מולקולרי עבור אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, או PAGE. הפעל ג'ל SDS-PAGE באמצעות מאגר פועל 1X MES וזרם של 200 וולט למשך 35 דקות.הסר את הג'ל מן הקלטת ולהחיל זרם 50 וולט במשך שעה אחת לפחות כדי להעביר את החלבונים נפתרו לקרום ניטרוצלולוז 0.2 מיקרומטר. לבסוף, בצע את ניתוח הכתם המערבי כדי להעריך את החלבונים. ג'ל SDS-PAGE המוכתם בכסף מדגים את פרופיל החלבון הכולל עבור כל שבר.הנתונים מראים כי השברים המאוחרים יותר מכילים יותר חלבון ודומים לחומר 100R. כתמים מערביים המזהים LAM, LpqH ו-GroES מראים כי סמן החלבון משתנה על פני השברים. מיקרוסקופיית אלקטרונים של הולכה, או תמונות TEM, של שברים SEC 1 עד 3 שנמשכו לפני הקיבוע מוצגות כאן.האולטרה-צנטריפוגציה של מעבר הצפיפות של כלי רכב חשמליים Mtb הוכתמה באופן שלילי עבור הדמיית TEM. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או התפלגות NTA, של שברים SEC 1 עד 3 מוצג כאן. כלי הרכב החשמליים מסוג Mtb של אולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע צפיפות נותחו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, והתפלגות הגודל מוצגת כאן.פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לטיהור EV משלושה מיליגרם של 100R. אם עומס החלבון מגוון, אסטרטגיית הדילול וה-BCA המומלצים על שברים המתקבלים עשויים לדרוש התאמה. רכבים חשמליים Mtb שהוכנו בטכניקה זו יכולים לשמש למחקרים מבוססי קומפוזיציה במורד הזרם ומבוססי אומיקה.הם מתאימים גם לניסויים in vitro ו- in vivo. טכניקה זו מספקת דרך יעילה ויעילה לייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה, וסוללת את הדרך לשכפול מוגבר בניסויים עתידיים של Mtb EV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...