Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

हम एनकेजी को कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन एंड बायोमेडिकल साइंसेज एक्सपीरिएंशियल अवार्ड और कॉलेज रिसर्च काउंसिल साझा अनुसंधान कार्यक्रम से समर्थन और केएमडी को एटीसीसी (पुरस्कार # 2016-0550-0002) द्वारा वित्त पोषण स्वीकार करना चाहते हैं। हम निम्नलिखित अभिकर्मकों के लिए तकनीकी सहायता और बीईआई संसाधन, एनआईएआईडी, एनआईएच के लिए ऐनी सिम्पसन को भी स्वीकार करना चाहते हैं: मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एलपीक्यूएच (जीन आरवी 3763), आईटी -54 (इन विट्रो में उत्पादित), एनआर -13792, मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस ग्रोईएस (जीन आरवी 3418 सी), क्लोन आईटी -3

कोलोराडो स्टेट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल बायोसेफ्टी कमेटी ने वर्तमान अध्ययन (19-046 बी) को मंजूरी दी। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस की खेती और ईवी समृद्ध संस्कृति सतह पर तैरनेवालों की कटाई एक उच्च-...

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	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस बाह्य पुटिकाएं अत्यधिक एंटीजेनिक जलाशय हैं, जो उन्हें नैदानिक उपकरण और भविष्य के टीके 4,19,20 विकसित करने के लिए एक आकर्षक एवेन्यू के रूप में<s...

रोगजनकों द्वारा बाह्य पुटिका (ईवी) रिलीज संक्रामक रोगों को नियंत्रित करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों को अनलॉक करने की कुंजी हो सकतीहै 1. माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) उच्च परिणाम का एक रोगज़नक़ है, जो दुनिया की लगभग एक तिहाई आबादी को संक्रमित करता है और हर साल लाखों लोगों के जीवन का दावा करताहै। एमटीबी द्वारा ईवी उत्पादन संक्रमण 3,4,5 के संदर्भ में इन ईवीएस के बायोजेनेसिस और विभिन्न भूमिकाओं (यानी, इम्यूनोस्टिमुलेटरी, इम्यूनोसप्रेसिव, लौह और पोषक तत्व अधिग्रहण) में अभी तक मायावी है। एमटीबी ईवीएस की संरचना को समझने के प्रयासों से प्लाज्मा झिल्ली से प्राप्त 50-150 एनएम लिपिड झिल्ली-संलग्न क्षेत्रों का पता चला जिसमें लिपिड और इम्यूनोलॉजिकल महत्व 3,6 के प्रोटीन होते हैं। जीवाणु शरीर विज्ञान में एमटीबी ईवी की भूमिका की जांच से अस्तित्व के लिए पर्यावरणीय तनाव के जवाब में बैक्टीरिया ईवी मॉड्यूलेशन के महत्व का पता चलाहै 5. मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन अध्ययन व्याख्या करने के लिए अधिक जटिल रहे हैं, लेकिन सबूत बताते हैं कि एमटीबी ईवीएस मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं और संभावित रूप से एक प्रभावी टीकाकरण घटक 3,4,7 के रूप में काम कर सकते हैं।
एमटीबी ईवीएस के अधिकांश अध्ययन इस प्रकार अब तक पुटिका संवर्धन8 के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पर निर्भर हैं। यह छोटे पैमाने पर अध्ययन के लिए प्रभावी रहा है; हालाँकि, इस तकनीक में कई तकनीकी और तार्किक चुनौतियां हैं। वैकल्पिक वर्कफ़्लोजो मल्टीस्टेप सेंट्रीफ्यूजेशन, पूरे कोशिकाओं और बड़े मलबे को हटाने के लिए, गोली ईवीएस के लिए एक अंतिम अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण के साथ। यह पद्धति दक्षता में भिन्न हो सकती है, और अक्सर घुलनशील गैर-पुटिका से जुड़े बायोमोलेक्यूल्स की कम उपज और सह-शुद्धि के परिणामस्वरूप पुटिका अखंडता9 को भी प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रक्रिया समय लेने वाली, मैन्युअल रूप से गहन है, और उपकरण की कमी के कारण थ्रूपुट में बहुत सीमित है।
वर्तमान प्रोटोकॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक वैकल्पिक तकनीक का वर्णन करता है: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)। इस पद्धति को पर्यावरण माइकोबैक्टीरिया के लिए प्रदर्शित किया गया है, और वर्तमान कार्य में, इसे एमटीबी10 तक एक्सट्रपलेशन किया गया है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम और स्वचालित अंश कलेक्टर पुटिका तैयारी में स्थिरता में सुधार कर सकता है और विशिष्ट, महंगे उपकरणों की आवश्यकता को कम कर सकता है। घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में समय के एक अंश में इस प्रोटोकॉल को पूरा करना भी संभव है, थ्रूपुट को बढ़ाना। यह तकनीक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, जिससे मास्टर करना आसान हो जाता है, और अंतर / इंट्रा-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता बढ़ सकती है। अंत में, एसईसी में उच्च पृथक्करण दक्षता है और कोमल है, पुटिकाओं की अखंडता को संरक्षित करता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

जीवाणु संक्रमण के संदर्भ में बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) की भूमिका माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक नए एवेन्यू के रूप में उभरी है। विशेष रूप से, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) ईवीएस मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत और पर्यावरणीय तनाव की प्रतिक्रिया में भूमिका निभाते हैं। एमटीबी ईवी भी अत्यधिक एंटीजेनिक हैं और वैक्सीन घटकों के रूप में क्षमता दिखाते हैं। एमटीबी ईवीएस को शुद्ध करने का सबसे आम तरीका घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन है। इस प्रक्रिया में कई सीमाएं हैं, जिनमें कम थ्रूपुट, कम उपज, महंगे उपकरणों पर निर्भरता, तकनीकी चुनौतियां शामिल हैं, और यह परिणामी तैयारी को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एक जेंटलर वैकल्पिक विधि है जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की कई सीमाओं का मुकाबला करती है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एसईसी एमटीबी ईवी संवर्धन के लिए प्रभावी है और तेजी से और स्केलेबल तरीके से बढ़ी हुई उपज की उच्च गुणवत्ता वाले एमटीबी ईवी तैयारी का उत्पादन करता है। इसके अतिरिक्त, परिमाणीकरण और योग्यता प्रक्रियाओं द्वारा घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना एसईसी के लाभों को दर्शाती है। जबकि ईवी मात्रा (नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण), फेनोटाइप (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), और सामग्री (पश्चिमी सोख्ता) का मूल्यांकन एमटीबी ईवीएस के अनुरूप है, प्रदान किए गए वर्कफ़्लो को अन्य माइकोबैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है।

माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) से संस्कृति छानना प्रोटीन (सीएफपी) केंद्रित, मात्रा निर्धारित किया गया था, और फिर 3 मिलीग्राम सामग्री को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) कॉलम पर लागू कि?...

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Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

यह प्रोटोकॉल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, संस्कृति सतह पर तैरनेवालों से माइकोबैक्टीरियम तपेदिक बाह्य पुटिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन करता है।

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बाह्य पुटिका संवर्धन

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस, एमटीबी ईवीएस से बाह्य पुटिकाओं के संवर्धन के लिए आवश्यक तकनीकी जटिलता और समय को कम करता है। यह पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और घनत्व-आधारित तकनीकों के लिए एक सौम्य विकल्प प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे प्रदर्शन करना आसान है, जिससे यह अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाता है।यह न्यूनतम गैर-ईवी प्रोटीन सह-संवर्धन के साथ एमटीबी ईवी की उच्च उपज प्रदान करता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जोनी रयान, हमारी प्रयोगशाला के एक पूर्व स्नातक छात्र होगा। शुरू करने के लिए, पीबीएस की पूर्ण मात्रा क्षमता जोड़कर 100 किलोडाल्टन आणविक भार कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर तैयार करें।4 डिग्री सेल्सियस पर 2, 800 गुना जी पर पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। फ्लोथ्रू और किसी भी शेष पीबीएस को त्यागें, और अपनी अधिकतम क्षमता तक एमटीबी सीएफपी के साथ नमूना कक्ष भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2, 800 गुना जी पर अपकेंद्रित्र जब तक कि मात्रा अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस की न्यूनतम मात्रा तक कम नहीं हो जाती।आवश्यकतानुसार दोहराएं जब तक कि पूरे नमूने को पर्याप्त रूप से कम नहीं किया जाता है। कुल डिवाइस क्षमता तक ध्यान केंद्रित करने वाले फिल्टर यूनिट में 1 एक्स पीबीएस जोड़ें। पहले वर्णित वॉल्यूम को कम करें और पूर्ण धोने और बफर विनिमय सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को पांच बार दोहराएं।फिर, अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस विनिर्देशों के अनुसार, 100-किलोडाल्टन केंद्रित सीएफपी रिटेंटेट या 100 आर को पुनर्प्राप्त करें। फिल्टर को कम से कम तीन बार 1 एक्स पीबीएस की न्यूनतम मात्रा के साथ धोएं, और वसूली को अधिकतम करने के लिए 100 आर के साथ धोएं। पीबीएस में नमूनों के कई कमजोर पड़ने का उपयोग करें और एक बिसिनकोनिक परख के साथ 100 आर सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।ट्रिप्लिकेट में नमूने का परीक्षण करें। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, या एसईसी कॉलम को कमरे के तापमान को संतुलित करने की अनुमति दें। टॉवर यूनिट के पीछे पावर स्विच का उपयोग करके एएफसी चालू करें और लोड सेल के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए आवश्यक होने पर मुख्य मेनू टच स्क्रीन पर सेटअप दबाएं।सेटअप स्क्रीन से, कैलिब्रेट के बाद हिंडोला का चयन करके हिंडोला संरेखित करें। एएफसी टॉवर में सामना करने वाले 13 छोटे छेदों के साथ हिंडोला डालें और माइनस या प्लस बटन दबाकर हिंडोला को समायोजित करें ताकि द्रव नोजल सीधे फ्लश स्थिति से ऊपर हो। संतुलित एसईसी कॉलम से कैप्स निकालें और एसईसी कॉलम को उपयुक्त कॉलम माउंट में स्लाइड करें।सावधानी से इसे एएफसी टॉवर पर स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि कॉलम पर रेडियो फ्रीक्वेंसी पहचान टैग एएफसी का सामना करता है, और जांचें कि कॉलम और वाल्व के बीच कनेक्शन सुरक्षित है। एक संग्रह कंटेनर में अपशिष्ट आउटलेट ट्यूबिंग रखें।सेटअप स्क्रीन से, संग्रह अनुसूची का चयन करें और माइनस या प्लस बटन दबाकर गिनती को 13 और आकार को 0.5 मिलीलीटर पर सेट करें। 2.7 मिलीलीटर के डिफ़ॉल्ट के रूप में बफ़र वॉल्यूम सेटिंग छोड़ दें, और उसके बाद संग्रह शेड्यूल विंडो बंद करें। होम स्क्रीन से संग्रह प्रारंभ करें का चयन करें और हाँ का चयन करके संग्रह पैरामीटर की पुष्टि करें।लोड 13 ढक्कन के साथ 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को खोलें और हिंडोला केंद्र की ओर इशारा करते हुए। ओके का चयन करके एएफसी को आगे बढ़ाएं, फिर कॉलम जलाशय को माउंट करें और ओके दबाकर फिर से आगे बढ़ें। हाँ दबाकर स्तंभ को फ्लश करने के विकल्प का चयन करें, और किसी भी भंडारण बफर को हटाने के लिए 0.2 माइक्रोमीटर फ़िल्टर्ड पीबीएस का एक कॉलम वॉल्यूम जोड़ें। एक बार फ्लश पूरा हो जाने के बाद, ओके दबाकर एएफसी को आगे बढ़ाएं। एएफसी के ऊपर हिंडोला कवर रखें और ठीक दबाएं। स्तंभ से किसी भी अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।1 एक्स पीबीएस के साथ 500 माइक्रोलीटर के लिए 100 आर नमूने के तीन मिलीग्राम लाओ और कॉलम के शीर्ष पर नमूना जोड़ें। 0.2 माइक्रोमीटर फ़िल्टर्ड पीबीएस की एक कॉलम वॉल्यूम तैयार करें। एएफसी अग्रिम और नमूना झल्लाहट में चलाने के लिए अनुमति देते हैं।एक बार नमूना पूरी तरह से स्तंभ में प्रवेश कर जाने के बाद, जलाशय में पहले तैयार पीबीएस जोड़ें। एएफसी के रन की निगरानी करें, जबकि यह पहले शून्य मात्रा और फिर निर्दिष्ट अंशों को एकत्र करता है। रन पूरा होने के बाद और हिंडोला अपशिष्ट स्थिति में लौटता है, हिंडोला से कवर और अंश ट्यूबों को हटा दें।100 आर एमटीबी सीएफपी के तीन मिलीग्राम से एकत्र किए गए 0.5 मिलीमीटर अंशों के लिए, ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के 1 से 7 अंशों के लिए 1: 3 कमजोर पड़ने के साथ माइक्रो-बीसीए का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें। 5 से 13 की संख्या वाले 0.5 मिलीलीटर अंशों के लिए, ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के लिए कोई कमजोर पड़ने के साथ बीसीए का उपयोग करें। प्रत्येक अंश के 10 माइक्रोलीटर और सीएफपी और 100 आर के पांच माइक्रोग्राम में एसडीएस नमूना बफर जोड़ें।100 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए उबालें। फिर पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन, या पेज के लिए आणविक भार सीढ़ी के साथ 4 से 12% बिस-ट्रिस जेल पर लोड करें। 1 एक्स एमईएस रनिंग बफर और 35 मिनट के लिए 200 वोल्ट करंट का उपयोग करके एसडीएस-पेज जेल चलाएं।कैसेट से जेल निकालें और हल किए गए प्रोटीन को 0.2 माइक्रोमीटर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए कम से कम एक घंटे के लिए 50-वोल्ट करंट लागू करें। अंत में, प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करें। चांदी के साथ दाग वाला एक एसडीएस-पेज जेल प्रत्येक अंश के लिए समग्र प्रोटीन प्रोफ़ाइल को दर्शाता है।डेटा से पता चलता है कि बाद के अंशों में अधिक प्रोटीन होता है और 100 आर सामग्री जैसा दिखता है। एलएएम, एलपीक्यूएच और ग्रोईएस का पता लगाने वाले पश्चिमी धब्बे दर्शाते हैं कि प्रोटीन मार्कर अंशों में बदलता है। निर्धारण से पहले खींचे गए एसईसी अंशों 1 से 3 की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या टीईएम छवियां यहां दिखाई गई हैं।एमटीबी ईवी के घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन को टीईएम इमेजिंग के लिए नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था। एसईसी अंश 1 से 3 के नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, या एनटीए वितरण, यहां दिखाया गया है। घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन एमटीबी ईवीएस का विश्लेषण नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ किया गया था, और आकार वितरण यहां प्रदर्शित किया गया है।इस प्रोटोकॉल को 100 आर के तीन मिलीग्राम से ईवी शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि प्रोटीन लोड विविध है, तो परिणामी अंशों पर अनुशंसित कमजोर पड़ने और बीसीए रणनीति को समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। इस तकनीक के साथ तैयार एमटीबी ईवी का उपयोग डाउनस्ट्रीम रचना और ओमिक्स-आधारित अध्ययनों के लिए किया जा सकता है।वे इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों के लिए भी उपयुक्त हैं। यह तकनीक उच्च गुणवत्ता वाले एमटीबी ईवी तैयारी का उत्पादन करने के लिए एक आसान और कुशल तरीका प्रदान करती है, जो भविष्य के एमटीबी ईवी प्रयोगों में बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता का मार्ग प्रशस्त करती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

नमूने की तैयारी<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; परमाणु चुंबकीय अनुनाद metabolomic अध्ययन के लिए अर्क

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

के विकास माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

प्राकृतिक ट्रांसमिशन पर क्षय रोग मलेरिया coinfection अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग और प्लाज्मोडियम berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

एक बहु दवा प्रतिरोधी दिखाते<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; प्रवर्धन माइक्रोएरे

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

ठीक करने के लिए एक उपन्यास Microdissection दृष्टिकोण<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</emफेफड़े granulomas एंबेडेड formalin तय आयल से&gt; विशिष्ट देखिए

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक 3 डी मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; संक्रमण

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

इंट्रासेलुलर लक्ष्य निर्धारण इनहिबिटर्स की प्रभावकारिता और cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए सिस्टम<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

एक उच्च throughput संगत परख Macrophage passaged के खिलाफ ड्रग प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

इमेजिंग रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति के साथ चूहों में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

मलेरिया संक्रमण के दौरान Extracellular पुटिका समारोह का मूल्यांकन

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...