Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
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Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.

Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la...

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	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia effica...

Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione 3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico 3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l'importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza5. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell'ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace 3,4,7.
La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità per l'arricchimento dellevescicole 8. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l'integrità dellevescicole 9. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.
Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all'ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb10. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all'ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un'elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l'integrità delle vescicole.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell'infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell'interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell'ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l'arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l'ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.

La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi int...

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Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Questo protocollo riduce la complessità tecnica e il tempo necessario per l'arricchimento di vescicole extracellulari da Mycobacterium tuberculosis, EV Mtb. Fornisce un'alternativa delicata alle tradizionali tecniche di ultracentrifugazione e basate sulla densità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire, rendendola più riproducibile.Fornisce un'alta resa di EV Mtb con un minimo co-arricchimento proteico non-EV. A dimostrare la procedura sarà Joanie Ryan, ex studentessa laureata del nostro laboratorio. Per iniziare, preparare un filtro centrifugo di taglio del peso molecolare da 100 kilodalton aggiungendo l'intera capacità volumetrica di PBS.Centrifugare per cinque minuti a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius. Scartare il flowthrough e qualsiasi PBS rimanente e riempire la camera di campionamento con Mtb CFP alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius fino a quando il volume si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione.Se necessario, ripetere fino a quando l'intero campione non sia stato sufficientemente ridotto. Aggiungere 1X PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto in precedenza e ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio di tampone.Quindi, recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kilodalton o 100R, secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione. Lavare il filtro con un volume minimo di 1X PBS almeno tre volte e tirare il lavaggio con 100R per massimizzare il recupero. Utilizzare diverse diluizioni di campioni in PBS e quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninic.Testare il campione in triplice copia. Consentire la cromatografia di esclusione dimensionale, o colonna SEC, per equilibrare a temperatura ambiente. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e, se necessario, premere Setup sul touch screen del menu principale per regolare le impostazioni della cella di carico.Dalla schermata di configurazione, allineare il carosello selezionando Carousel seguito da Calibrate. Inserire il carosello con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare il carosello premendo i pulsanti meno o più in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di lavaggio. Rimuovere i tappi dalla colonna SEC equilibrata e far scorrere la colonna SEC nel supporto della colonna appropriato.Installarlo con cura sulla torre AFC. Assicurarsi che l'etichetta di identificazione a radiofrequenza sulla colonna sia rivolta verso l'AFC e verificare che il collegamento tra la colonna e la valvola sia sicuro. Posizionare il tubo di scarico dei rifiuti in un contenitore di raccolta.Dalla schermata di configurazione, selezionare Programma di raccolta e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 millilitri premendo i pulsanti meno o più. Lasciare l'impostazione del volume del buffer come predefinita di 2,7 millilitri, quindi chiudere la finestra di pianificazione della raccolta. Selezionare Avvia raccolta dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando Sì.Carico 13 tubi di microcentrifuga etichettati da 1,7 millilitri con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra. Avanzare l'AFC selezionando OK, quindi montare il serbatoio della colonna e avanzare di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo Sì e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il flush (AFC), far avanzare l'AFC premendo OK. Posizionare il coperchio del carosello sull'AFC e premere OK. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali buffer in eccesso dalla colonna.Portare tre milligrammi di campione 100R a 500 microlitri con 1X PBS e aggiungere il campione nella parte superiore della colonna. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri. Far avanzare l'AFC e lasciare che il campione si svolga nel tastio.Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato in precedenza al serbatoio. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume vuoto e quindi le frazioni specificate. Al termine della corsa e la giostra ritorna nella posizione di scarico, rimuovere il coperchio e i tubi di frazione dal carosello.Per frazioni di 0,5 millimetri raccolte da tre milligrammi di CFP 100R Mtb, misurare la concentrazione proteica utilizzando il micro-BCA con una diluizione 1:3 per le frazioni numerate da 1 a 7 di ciascun campione in triplice copia. Per frazioni da 0,5 millilitri numerate da 5 a 13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia. Aggiungere tampone campione SDS a 10 microlitri di ciascuna frazione e cinque microgrammi di CFP e 100R.Far bollire per cinque minuti a 100 gradi Celsius. Quindi caricare su un gel Bis-Tris dal 4 al 12% con una scala a peso molecolare per elettroforesi su gel di poliacrilammide o PAGE. Eseguire un gel SDS-PAGE utilizzando un buffer MES 1X e una corrente di 200 volt per 35 minuti.Rimuovere il gel dalla cassetta e applicare una corrente di 50 volt per un minimo di un'ora per trasferire le proteine risolte su una membrana nitrocellulosa di 0,2 micrometri. Infine, eseguire l'analisi Western blot per valutare le proteine. Un gel SDS-PAGE colorato con argento dimostra il profilo proteico complessivo per ogni frazione.I dati mostrano che le frazioni successive contengono più proteine e assomigliano al materiale 100R. I Western blot che rilevano LAM, LpqH e GroES dimostrano che i marcatori proteici cambiano tra le frazioni. Qui sono mostrate la microscopia elettronica a trasmissione, o immagini TEM, delle frazioni SEC da 1 a 3 tirate prima della fissazione.L'ultracentrifugazione del gradiente di densità dei veicoli elettrici Mtb è stata colorata negativamente per l'imaging TEM. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o distribuzione NTA, delle frazioni SEC da 1 a 3 è mostrata qui. I veicoli elettrici Mtb a ultracentrifugazione a gradiente di densità sono stati analizzati con analisi di tracciamento delle nanoparticelle e la distribuzione delle dimensioni è visualizzata qui.Questo protocollo è stato ottimizzato per la purificazione EV da tre milligrammi di 100R. Se il carico proteico è variato, la diluizione raccomandata e la strategia BCA sulle frazioni risultanti possono richiedere aggiustamenti. I veicoli elettrici Mtb preparati con questa tecnica possono essere utilizzati per studi composizionali e omici a valle.Sono adatti anche per esperimenti in vitro e in vivo. Questa tecnica fornisce un modo semplice ed efficiente per produrre preparati EV Mtb di alta qualità, aprendo la strada a una maggiore riproducibilità nei futuri esperimenti di EV Mtb.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...