Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

獣医学部・生物医学科学部体験賞と大学研究評議会共有研究プログラムからNKGへの支援と、ATCC(賞#2016-0550-0002)によるKMDへの資金提供に感謝します。我々はまた、技術サポートについてアン・シンプソン、NIAID、NIHの以下の試薬について、以下の試薬について感謝したいと思います:モノクローナル抗結核菌LpqH(ジーンRv3763)、IT-54(インビトロで生産)、NR-13792、モノクローナル抗結核菌GroES(遺伝子Rv3418c)、クローンIT-3(SA-12)(インビトロで生産)、NR-49223、およびモノクローナル抗結核菌LAM、クローンCS-35(インビトロで生産)、NR-13811。

コロラド州立大学機関バイオセーフティ委員会は、本研究を承認した(19-046B)。 結核菌 の培養とEVに富む培養上清の採取は、高封じ込め研究所の訓練を受けた職員によって行われました。材料は、有効な不活性化方法が実施され、確認され、および機関のバイオセーフティポリシーによって承認された後、高封じ込め領域から移動された。プロトコルを複製している間に、検証された不...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

結核菌の細胞外小胞は抗原性の高い貯留層であり、診断ツールや将来のワクチンを開発するための魅力的な道として提示されています4,19,20。歴史的に、密度勾配超遠心分離は、Mtb EVを他の可溶性、分泌物質8から分離するために使用されてきた。このプロセスは効果的ですが、時間がかかり、技術?...

病原体による細胞外小胞(EV)放出は、感染症を制御するための新しい技術を解き放つ鍵となる可能性がある1。 結核菌(Mtb)は、世界人口の約3分の1に感染し、毎年何百万人もの人々の命を奪っている、重大な結果をもたらす病原体です2。MtbによるEV生産は、感染の文脈におけるこれらのEVの生合成および様々な役割(すなわち、免疫刺激性、免疫抑制性、鉄および栄養素の獲得)において十分に文書化されているが、とらえどころがない3,4,5。Mtb EVsの組成を理解するための努力は、免疫学的に重要な脂質およびタンパク質を含む原形質膜に由来する50〜150nmの脂質膜封入スフェアを明らかにした3,6。細菌生理学におけるMtb EVの役割の調査により、生存のための環境ストレスに対する細菌EV調節の重要性が明らかになった5。宿主-病原体相互作用研究は解釈がより複雑であったが、Mtb EVが宿主の免疫応答に影響を与え、効果的なワクチン接種成分として潜在的に役立つ可能性があることを示す証拠がある3,4,7。
これまでのところ、Mtb EVのほとんどの研究では、小胞濃縮のために密度勾配超遠心分離に依存してきました8。これは小規模な研究に効果的です。ただし、この手法にはいくつかの技術的および物流上の課題があります。代替ワークフローは、全細胞と大きな破片を除去するための多段階遠心分離と、EVをペレット化する最終的な超遠心分離ステップを組み合わせます。この方法論は、効率が異なり得、そしてしばしば、可溶性非小胞関連生体分子の低収率および共精製をもたらし、小胞の完全性にも影響を及ぼす9。さらに、このプロセスは時間がかかり、手作業に時間がかかり、機器の制約によりスループットが非常に制限されています。
本プロトコルは、密度勾配超遠心分離に代わる技術であるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)について記載する。この方法は環境マイコバクテリアについて実証されており、現在の研究ではMtb10に外挿されている。市販のカラムおよび自動分画コレクターは、小胞調製における一貫性を改善し、特定の高価な装置の必要性を低減することができます。密度勾配超遠心分離と比較して数分の一の時間でこのプロトコルを完了し、スループットを増加させることもできる。この技術は技術的に難しくなく、習得が容易になり、実験室間/実験室内の再現性を高めることができます。最後に、SECは分離効率が高く、穏やかで、小胞の完全性を維持します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

細菌感染の文脈における細胞外小胞(EV)の役割は、微生物生理学を理解するための新しい道として浮上している。具体的には、 結核菌 (Mtb)EVは、宿主と病原体の相互作用と環境ストレスに対する応答において役割を果たしている。Mtb EVも抗原性が高く、ワクチン成分としての可能性を示しています。Mtb EVを精製する最も一般的な方法は、密度勾配超遠心分離です。このプロセスには、低スループット、低収率、高価な機器への依存、技術的課題など、いくつかの制限があり、結果として得られる調製物に悪影響を及ぼす可能性があります。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、超遠心分離の限界の多くに対抗する、より穏やかな代替方法です。このプロトコルは、SECがMtb EV濃縮に効果的であり、迅速かつスケーラブルな方法で収量を増加させる高品質のMtb EV調製物を製造することを実証しています。さらに、定量および適格性認定手順による密度勾配超遠心分離との比較は、SECの利点を実証しています。EV量(ナノ粒子追跡解析)、表現型(透過型電子顕微鏡)、含有量(ウェスタンブロッティング)の評価はMtb EVに合わせて調整されていますが、提供されるワークフローは他の抗酸菌にも適用できます。

結 核菌 (Mtb)由来の培養濾液タンパク質(CFP)を濃縮、定量し、次いで3mgの物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムにアプライした。タンパク質および粒子濃度を、それぞれBCAおよびNTAによって列挙した。タンパク質および粒子回収の期待される範囲と、これらの結果について得られた正確な値を 表1に報告する。これらの範囲よりはるかに高い値は、汚染またはカラ?...

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Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

このプロトコルは、結核菌、Mtb EVからの細胞外小胞の濃縮に必要な技術的な複雑さと時間を削減します。従来の超遠心分離や密度ベースの技術に代わる穏やかな方法を提供します。この手法の主な利点は、実行が簡単で、再現性が高いことです。最小限の非EVタンパク質共濃縮で高収率のMtb EVを提供します。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の元大学院生であるジョアニーライアンです。まず、PBSの全容量を追加して、分子量100キロダルトンのカットオフ遠心フィルターを準備します。摂氏4度で2, 800倍Gで5分間遠心分離する。フロースルーと残りのPBSを廃棄し、サンプルチャンバーにMtb CFPを最大容量まで充填します。容積が限外ろ過装置の最小容積まで減少するまで、摂氏4度で2, 800倍Gで遠心分離する。サンプル全体が十分に減少するまで、必要に応じて繰り返します。濃縮物を含むフィルターユニットに1X PBSをデバイスの総容量まで追加します。前述のように容量を下げ、この手順を5回繰り返して、完全な洗浄とバッファー交換を確実にします。次いで、限外ろ過装置の仕様に従って、100キロダルトンの濃縮CFP保持液または100Rを回収する。1X PBSの最小容量でフィルターを少なくとも3回洗浄し、100Rで洗浄液を引っ張って回復を最大化します。PBS中のサンプルを数回希釈し、ビシンコニンアッセイで100R材料を定量します。サンプルを3連でテストします。サイズ排除クロマトグラフィー(SECカラム)を室温まで平衡化します。タワーユニットの背面にある電源スイッチを使用してAFCの電源を入れ、必要に応じてメインメニューのタッチスクリーンで[セットアップ]を押して、ロードセルの設定を調整します。セットアップ画面で、カルーセルを選択してから[キャリブレーション]を選択して、カルーセルの位置を合わせます。13個の小さな穴を上に向けてカルーセルをAFCタワーに挿入し、マイナスボタンまたはプラスボタンを押してカルーセルを調整し、流体ノズルがフラッシュ位置の真上になるようにします。平衡化されたSECカラムからキャップを取り外し、SECカラムを適切なカラムマウントにスライドさせます。AFCタワーに慎重に設置してください。カラムの高周波識別タグがAFCに面していることを確認し、カラムとバルブ間の接続がしっかりしていることを確認します。廃棄物出口チューブを収集容器に入れます。セットアップ画面で[収集スケジュール]を選択し、マイナスボタンまたはプラスボタンを押して、カウントを13に、サイズを0.5ミリリットルに設定します。バッファー容量の設定をデフォルトの 2.7 ミリリットルのままにして、収集スケジュールウィンドウを閉じます。ホーム画面から[収集の開始]を選択し、[はい]を選択して収集パラメータを確認します。蓋を開けてカルーセルの中心を向いた状態で、ラベルの付いた1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブを13本ロードします。[OK]を選択してAFCを進め、次にカラムリザーバーを取り付け、OKを押して再度進めます。[はい] を押してカラムをフラッシュするオプションを選択し、0.2 マイクロメートルのフィルター PBS のカラム容量を 1 つ追加して、ストレージ バッファーを削除します。フラッシュが完了したら、[OK]を押してAFCを進めます。カルーセルカバーをAFCの上に置き、[OK]を押します。ピペットを使用して、カラムから余分なバッファーを取り除きます。1X PBSで3ミリグラムの100Rサンプルを500マイクロリットルに持ち込み、サンプルをカラムの上部に追加します。0.2マイクロメートルのろ過PBSの1カラム容量を準備します。AFCを進め、サンプルをフレットに流します。サンプルがカラムに完全に入ったら、前に準備したPBSをリザーバーに追加します。AFCの実行を監視しながら、最初にボイドボリュームを収集し、次に指定されたフラクションを収集します。実行が完了し、カルーセルが廃棄物の位置に戻ったら、カバーとフラクションチューブをカルーセルから取り外します。3ミリグラムの100R Mtb CFPから採取した0.5ミリメートルの画分について、各サンプルの1〜7の番号が付けられた画分を3:3に希釈したマイクロBCAを使用してタンパク質濃度を測定します。5〜13の番号が付けられた0.5ミリリットルの画分の場合、3連の各サンプルに希釈せずにBCAを使用します。SDSサンプルバッファーを各フラクション10マイクロリットルと5マイクログラムのCFPおよび100Rに加えます。摂氏100度で5分間煮る。次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の分子量ラダーまたはPAGEを備えた4〜12%ビストリスゲルにロードします。1X MESランニングバッファーと200ボルトの電流を使用してSDS-PAGEゲルを35分間実行します。カセットからゲルを取り出し、50ボルトの電流を最低1時間印加して、分解されたタンパク質を0.2マイクロメートルのニトロセルロースメンブレンに移します。最後に、ウェスタンブロット解析を行い、タンパク質を評価します。銀で染色されたSDS-PAGEゲルは、各画分の全体的なタンパク質プロファイルを示しています。データは、後の画分がより多くのタンパク質を含み、100R材料に似ていることを示しています。LAM、LpqH、およびGroESを検出するウェスタンブロットは、タンパク質マーカーが画分間で変化することを示しています。固定前に引っ張られたSECフラクション1〜3の透過型電子顕微鏡またはTEM画像がここに示されています。Mtb EVの密度勾配超遠心分離は、TEMイメージングのために陰性染色されました。SECフラクション1〜3のナノ粒子追跡分析(NTA分布)を以下に示します。密度勾配超遠心Mtb EVをナノ粒子追跡分析で分析し、サイズ分布をここに表示します。このプロトコルは、3ミリグラムの100RからのEV精製用に最適化されています。タンパク質負荷が変動する場合、得られた画分に対する推奨される希釈およびBCA戦略の調整が必要になる場合があります。この技術で調製されたMtb EVは、下流の組成研究やオミクスベースの研究に使用できます。また、インビトロおよびインビボ実験にも適しています。この技術は、高品質のMtb EV調製物を簡単かつ効率的に製造する方法を提供し、将来のMtb EV実験における再現性の向上への道を開きます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

多剤耐性を実証<em&gt;結核菌</em&gt;増幅マイクロアレイ

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em&gt;結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から&gt;特異的転写

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

結核菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮