Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Vi ønsker å anerkjenne støtte fra College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award og College Research Council Shared Research Program til NKG og finansiering av ATCC (award # 2016-0550-0002) til KMD. Vi ønsker også å anerkjenne Anne Simpson for teknisk støtte og BEI Resources, NIAID, NIH for følgende reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produsert in vitro), NR-13792, Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produsert in vitro), NR-49223 og Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produsert in vitro), NR-13811.

Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkjente denne studien (19-046B). Dyrking av Mycobacterium tuberculosis og høsting av ev-rike kultursupernatanter ble utført av opplært personell i et høyoppsamlingslaboratorium. Materialene ble flyttet ut av høyoppsamlingsområdet etter at en gyldig inaktiveringsmetode ble utført, bekreftet og godkjent av institusjonelle biosikkerhetspolitikker. Selv om det ikke er mulig å replikere protokollen, hvis validert inaktivering eller steril filtrerin...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er svært antigene reservoarer, som presenterer dem som en attraktiv vei for å utvikle diagnostiske verktøy og fremtidige vaksiner 4,19,20. Historisk sett har tetthetsgradient ultrasentrifugering blitt brukt til å skille Mtb-elbiler fra andre løselige, utskilte materialer8. Selv om denne prosessen er effektiv, er den også tidkrevende, tekn...

Frigjøring av ekstracellulære vesikkel (EV) av patogener kan være nøkkelen til å låse opp ny teknologi for å kontrollere smittsomme sykdommer1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen av høy konsekvens, infiserer omtrent en tredjedel av verdens befolkning og krever livet til millioner av mennesker hvert år2. EV-produksjon av Mtb er godt dokumentert, men likevel unnvikende i biogenesen og varierte roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern og næringsoppkjøp) av disse EV-ene i forbindelse med infeksjon 3,4,5. Forsøk på å forstå sammensetningen av Mtb EV avslørte 50-150 nm lipidmembranlukkede kuler avledet fra plasmamembranen som inneholder lipider og proteiner av immunologisk betydning 3,6. Undersøkelse av rollen til MTB EV i bakteriell fysiologi har avslørt betydningen av bakteriell EV-modulering som svar på miljøstress for overlevelse5. Host-patogen interaksjonsstudier har vært mer kompliserte å tolke, men bevis indikerer at Mtb EV kan påvirke immunresponsen til verten og potensielt kan tjene som en effektiv vaksinasjonskomponent 3,4,7.
De fleste studier av MTB-elbiler så langt har basert seg på tetthetsgradient ultrasentrifugering for vesikkelberikelse8. Dette har vært effektivt for småskala studier; Denne teknikken har imidlertid flere tekniske og logistiske utfordringer. Alternative arbeidsflyter par multistep sentrifugering, for fjerning av hele celler og store rusk, med en siste ultracentrifugation trinn til pellet EV. Denne metoden kan variere i effektivitet, og resulterer ofte i lavt utbytte og korensing av løselige ikke-vesikkelassosierte biomolekyler samtidig som den påvirker vesikkelategritet9. I tillegg er denne prosessen tidkrevende, manuelt intensiv og svært begrenset i gjennomstrømning på grunn av utstyrsbegrensninger.
Denne protokollen beskriver en alternativ teknikk til tetthetsgradient ultrasentrifugering: størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Denne metoden har blitt demonstrert for miljømykobakterier, og i det nåværende arbeidet har den blitt ekstrapolert til Mtb10. En kommersielt tilgjengelig kolonne- og automatisk fraksjonssamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og redusere behovet for spesifikt, dyrt utstyr. Det er også mulig å fullføre denne protokollen på en brøkdel av tiden sammenlignet med tetthetsgradient ultracentrifugation, noe som øker gjennomstrømningen. Denne teknikken er mindre teknisk utfordrende, noe som gjør det lettere å mestre, og kan øke inter / intra-laboratoriet reproduserbarhet. Endelig har SEC høy separasjonseffektivitet og er mild, og bevarer vesiklernes integritet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Rollen til ekstracellulære vesikler (EV) i sammenheng med bakteriell infeksjon har dukket opp som en ny vei for å forstå mikrobiell fysiologi. Spesielt spiller Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV en rolle i vertspatogeninteraksjonen og responsen på miljøstress. Mtb-elbiler er også svært antigene og viser potensial som vaksinekomponenter. Den vanligste metoden for rensing av MTB-elbiler er tetthetsgradient ultrasentrifugering. Denne prosessen har flere begrensninger, inkludert lav gjennomstrømning, lavt utbytte, avhengighet av dyrt utstyr, tekniske utfordringer, og det kan påvirke den resulterende forberedelsen negativt. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) er en mildere alternativ metode som bekjemper mange av begrensningene ved ultrasentrifugering. Denne protokollen viser at SEC er effektiv for Mtb EV-anrikning og produserer Mtb EV-preparater av høy kvalitet med økt utbytte på en rask og skalerbar måte. I tillegg demonstrerer en sammenligning med tetthetsgradient ultracentrifugering ved kvantifiserings- og kvalifiseringsprosedyrer fordelene med SEC. Mens evalueringen av EV-mengde (nanopartikkelsporingsanalyse), fenotype (transmisjonselektronmikroskopi) og innhold (Western blotting) er skreddersydd for MTB EV, kan arbeidsflyten som tilbys brukes på andre mykobakterier.

Kulturfiltratprotein (CFP) fra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ble konsentrert, kvantifisert, og deretter ble 3 mg materiale påført en størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) kolonne. Protein- og partikkelkonsentrasjonene ble oppregnet av henholdsvis BCA og NTA. Forventede områder for protein- og partikkelutvinning pluss de nøyaktige verdiene oppnådd for disse resultatene er rapportert i tabell 1. Verdier som er mye høyere enn disse områdene, kan indikere kontaminering eller problemer m...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Denne protokollen beskriver størrelseseksklusjonskromatografi, en lettvint og reproduserbar teknikk for å berike Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler fra dyrkningssupernatanter.

Mycobacterium tuberculosis Ekstracellulær vesikkelberikelse gjennom størrelsesekskluderingskromatografi

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Denne protokollen reduserer den tekniske kompleksiteten og tiden som kreves for anrikning av ekstracellulære vesikler fra Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV. Det gir et mildt alternativ til tradisjonell ultracentrifugering og tetthetsbaserte teknikker. Den største fordelen med denne teknikken er at den er enkel å utføre, noe som gjør den mer reproduserbar.Det gir et høyt utbytte av Mtb EV med minimal ikke-EV protein co-anrikning. Demonstrere prosedyren vil være Joanie Ryan, en tidligere kandidatstudent i laboratoriet vårt. For å begynne, klargjør et 100 kilodalton molekylvekt cutoff sentrifugalfilter ved å legge til full volumkapasitet på PBS.Sentrifuge i fem minutter ved 2, 800 ganger G ved 4 grader Celsius. Kast gjennomstrømningen og eventuelle gjenværende PBS, og fyll prøvekammeret med Mtb CFP til maksimal kapasitet. Sentrifuge ved 2.800 ganger G ved 4 grader Celsius til volumet er redusert til minimumsvolumet til ultrafiltreringsanordningen.Gjenta etter behov til hele prøven er tilstrekkelig redusert. Legg til 1X PBS til filterenheten som inneholder konsentratet opp til total enhetskapasitet. Reduser volumet som beskrevet tidligere, og gjenta dette trinnet fem ganger for å sikre fullstendig vask og bufferbytte.Deretter gjenoppretter du 100-kilodalton konsentrert CFP retentate eller 100R, i henhold til spesifikasjonene for ultrafiltreringsenheten. Vask filteret med et minimalt volum på 1X PBS minst tre ganger, og trekk vasken med 100R for å maksimere restitusjonen. Bruk flere fortynninger av prøver i PBS og kvantifiser 100R-materialet med en bicinchoninisk analyse.Test prøven i tre eksemplarer. Tillat størrelsesekskluderingskromatografi, eller SEC-kolonne, å balansere til romtemperatur. Slå på AFC ved hjelp av strømbryteren på baksiden av tårnenheten, og trykk på Oppsett på hovedmenyens berøringsskjerm om nødvendig for å justere innstillingene for lastcellen.Fra oppsettskjermen justerer du karusellen ved å velge Karusell etterfulgt av Kalibrer. Sett karusellen med de 13 små hullene vendt opp i AFC-tårnet og juster karusellen ved å trykke på minus- eller plussknappene slik at væskedysen er rett over spyleposisjonen. Fjern hettene fra den likevektede SEC-kolonnen og skyv SEC-kolonnen inn i riktig kolonnemontering.Installer den forsiktig på AFC-tårnet. Forsikre deg om at radiofrekvensidentifikasjonsmerket på kolonnen vender mot AFC, og kontroller at forbindelsen mellom kolonnen og ventilen er sikker. Plasser avfallsutløpsslangen i en oppsamlingsbeholder.Fra oppsettskjermen velger du Innsamlingsplan og setter tellingen til 13 og størrelsen til 0,5 milliliter ved å trykke på minus- eller plussknappene. La buffervoluminnstillingen være standard på 2,7 milliliter, og lukk deretter vinduet for innsamlingsplan. Velg Start samling fra startskjermen, og bekreft innsamlingsparametrene ved å velge Ja.Last inn 13 merkede 1,7 milliliter mikrosentrifugerør med lokkene åpne og pekende mot karusellsenteret. Gå videre til AFC ved å velge OK, monter deretter kolonnereservoaret og gå videre igjen ved å trykke på OK. Velg alternativet for å skylle kolonnen ved å trykke Ja, og legg til ett kolonnevolum på 0,2 mikrometer filtrert PBS for å fjerne lagringsbufferen. Når spylingen er fullført, går du videre til AFC ved å trykke på OK. Plasser karuselldekselet over AFC og trykk OK. Bruk en pipette for å fjerne overflødig buffer fra kolonnen.Ta med tre milligram 100R-prøve til 500 mikroliter med 1X PBS og legg prøven til toppen av kolonnen. Forbered ett kolonnevolum på 0,2 mikrometer filtrert PBS. Advance AFC og la prøven kjøre inn i båndet.Når prøven har kommet helt inn i kolonnen, legger du til PBS som er utarbeidet tidligere i reservoaret. Overvåk kjøringen av AFC mens den først samler tomromsvolumet og deretter de angitte fraksjonene. Etter at kjøringen er fullført og karusellen går tilbake til avfallsposisjonen, fjern dekselet og fraksjonsrørene fra karusellen.For 0,5 millimeter fraksjoner samlet fra tre milligram 100R Mtb CFP, måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av mikro-BCA med en 1: 3 fortynning for fraksjoner nummerert 1 til 7 av hver prøve i tre eksemplarer. For 0, 5 milliliter fraksjoner nummerert 5 til 13, bruk BCA uten fortynning for hver prøve i tre eksemplarer. Legg SDS-prøvebuffer til 10 mikroliter av hver fraksjon og fem mikrogram CFP og 100R.Kok i fem minutter ved 100 grader Celsius. Last deretter på en 4 til 12% Bis-Tris gel med en molekylvektstige for polyakrylamidgelelektroforese, eller PAGE. Kjør en SDS-PAGE-gel med 1X MES løpebuffer og en 200 volt strøm i 35 minutter.Fjern gelen fra kassetten og påfør en 50 volt strøm i minst en time for å overføre de oppløste proteinene til en 0,2 mikrometer nitrocellulosemembran. Til slutt, utfør Western blot-analysen for å evaluere proteinene. En SDS-PAGE gel farget med sølv demonstrerer den totale proteinprofilen for hver fraksjon.Dataene viser at de senere fraksjonene inneholder mer protein og ligner 100R-materialet. Western blots som oppdager LAM, LpqH og GroES viser at proteinmarkøren endres over fraksjonene. Transmisjonselektronmikroskopi, eller TEM-bilder, av SEC-fraksjoner 1 til 3 trukket før fiksering er vist her.Tetthetsgradient ultracentrifugering av Mtb EV ble negativt farget for TEM-avbildning. Nanopartikkelsporingsanalysen, eller NTA-distribusjonen, av SEC-fraksjonene 1 til 3 er vist her. Tetthetsgradient ultracentrifugering Mtb EV ble analysert med nanopartikkelsporingsanalyse, og størrelsesfordelingen vises her.Denne protokollen er optimalisert for EV-rensing fra tre milligram 100R. Hvis proteinbelastningen er variert, kan den anbefalte fortynnings- og BCA-strategien på resulterende fraksjoner kreve justering. Mtb EV utarbeidet med denne teknikken kan brukes til nedstrøms komposisjonelle og omics-baserte studier.De er også egnet for in vitro og in vivo eksperimenter. Denne teknikken gir en enkel og effektiv måte å produsere høykvalitets Mtb EV-preparater, og baner vei for økt reproduserbarhet i fremtidige Mtb EV-eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vekst av Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentell modell for å studere Tuberkulose-Malaria coinfection på Natural Overføring av Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrerer en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification Mikromatrise

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

En roman microdissection tilnærming til Gjenopprette<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spesifikke Utskrift fra formalinfiksert parafin Embedded Lung Granulomer

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig lungevev Modell for funksjonelle studier på<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infeksjon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Effekt og Cytotoksisitet Screening av inhibitorer målretting Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

En High-throughput Kompatibel Assay å evaluere Drug Effekt mot macrophage passert<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...