Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Мы хотели бы выразить признательность NKG за поддержку со стороны Колледжа ветеринарной медицины и биомедицинских наук и Совместной исследовательской программы Исследовательского совета колледжа для NKG и финансирование ATCC (награда No 2016-0550-0002) KMD. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Симпсон за техническую поддержку и BEI Resources, NIAID, NIH за следующие реагенты: Моноклональные антимикобактерии туберкулеза LpqH (ген Rv3763), IT-54 (производится in vitro), NR-13792, моноклональные антимикобактерии туберкулеза GroES (ген Rv3418c), клон IT-3 (SA-12) (производится in vitro), NR-49223 и моноклональные антимикобактерии туберкулеза LAM, клон CS-35 (производится в пробирке), NR-13811.

Институциональный комитет по биобезопасности Университета штата Колорадо одобрил настоящее исследование (19-046B). Культивирование микобактерий туберкулеза и сбор богатых EV супернатантов культуры выполнялись обученным персоналом в лаборатории с высокой степенью локализации. Мат?...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Внеклеточные везикулы Микобактерии туберкулеза являются высокоантигенными резервуарами, что представляет их в качестве привлекательного направления для разработки диагностических инструментов и будущих вакцин 4,19,20. Историчес...

Высвобождение внеклеточных везикул (EV) патогенами может быть ключом к раскрытию новых технологий для борьбы с инфекционными заболеваниями1. Микобактерии туберкулеза (Mtb) являются возбудителем с высокими последствиями, заражая примерно одну треть населения мира и ежегодно унося жизни миллионов людей2. Производство EV Mtb хорошо документировано, но неуловимо в биогенезе и различных ролях (т.е. иммуностимулирующих, иммуносупрессивных, железо и питательных веществ) этих EV в контексте инфекции 3,4,5. Попытки понять состав Mtb EV выявили 50-150 нм липидных мембранно-замкнутых сфер, полученных из плазматической мембраны, содержащей липиды и белки иммунологического значения 3,6. Исследование роли Mtb EV в бактериальной физиологии выявило важность бактериальной модуляции EV в ответ на стресс окружающей среды для выживания5. Исследования взаимодействия хозяина и патогена были более сложными для интерпретации, но данные указывают на то, что Mtb EV могут влиять на иммунный ответ хозяина и потенциально могут служить эффективным компонентом вакцинации 3,4,7.
Большинство исследований Mtb EV до сих пор основывались на ультрацентрифугировании градиента плотности для обогащенияпузырьков 8. Это было эффективно для мелкомасштабных исследований; однако этот метод сопряжен с рядом технических и логистических проблем. Альтернативные рабочие процессы сочетают многоступенчатое центрифугирование для удаления целых клеток и крупного мусора с заключительным этапом ультрацентрифугирования для пеллетных электромобилей. Эта методология может варьироваться по эффективности и часто приводит к низкому выходу и совместной очистке растворимых биомолекул, не связанных с везикулами, а также влияет на целостностьпузырьков 9. Кроме того, этот процесс занимает много времени, интенсивно используется вручную и очень ограничен по пропускной способности из-за ограничений оборудования.
Настоящий протокол описывает альтернативный метод ультрацентрифугирования градиента плотности: хроматография с исключением размеров (SEC). Этот метод был продемонстрирован для экологических микобактерий, и в текущей работе он был экстраполирован на Mtb10. Коммерчески доступная колонна и автоматический коллектор фракций могут улучшить консистенцию в пузырной подготовке и уменьшить потребность в специальном, дорогостоящем оборудовании. Также можно завершить этот протокол за долю времени по сравнению с ультрацентрифугированием градиента плотности, увеличивая пропускную способность. Этот метод является менее технически сложным, что облегчает его освоение и может повысить межлабораторную воспроизводимость. Наконец, SEC обладает высокой эффективностью разделения и является щадящим, сохраняя целостность везикул.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Роль внеклеточных везикул (EV) в контексте бактериальной инфекции стала новым способом понимания микробной физиологии. В частности, mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV играют роль во взаимодействии хозяина и патогена и реакции на стресс окружающей среды. Mtb EV также очень антигенны и демонстрируют потенциал в качестве компонентов вакцины. Наиболее распространенным методом очистки Mtb EV является ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Этот процесс имеет несколько ограничений, включая низкую пропускную способность, низкую производительность, зависимость от дорогостоящего оборудования, технические проблемы, и это может негативно повлиять на полученную подготовку. Хроматография с исключением размеров (SEC) является более мягким альтернативным методом, который борется со многими ограничениями ультрацентрифугирования. Этот протокол демонстрирует, что SEC эффективен для обогащения Mtb EV и производит высококачественные препараты Mtb EV повышенной производительности быстрым и масштабируемым способом. Кроме того, сравнение с ультрацентрифугированием градиента плотности с помощью количественных и квалификационных процедур демонстрирует преимущества SEC. В то время как оценка количества EV (анализ отслеживания наночастиц), фенотипа (просвечивающая электронная микроскопия) и содержания (вестерн-блоттинг) адаптирована к Mtb EV, предоставленный рабочий процесс может быть применен к другим микобактериям.

Культуральный фильтрат белка (CFP) из Mycobacterium tuberculosis (Mtb) концентрировали, количественно оценивали, а затем 3 мг материала наносили на колонку эксклюзионной хроматографии (SEC). Концентрации белка и частиц были перечислены BCA и NTA соответственно. Ожидаемые диапазоны восстановления белк?...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Этот протокол описывает размерную эксклюзионную хроматографию, легкий и воспроизводимый метод обогащения внеклеточных везикул Mycobacterium tuberculosis из супернатантов культуры.

Микобактерии туберкулеза Обогащение внеклеточных пузырьков с помощью хроматографии с исключением размеров

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Этот протокол снижает техническую сложность и время, необходимое для обогащения внеклеточных везикул из Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV. Он обеспечивает мягкую альтернативу традиционным методам ультрацентрифугирования и плотности. Основным преимуществом данной методики является то, что ее легко выполнить, что делает ее более воспроизводимой.Он обеспечивает высокий выход Mtb EV с минимальным сообогащением белка без EV. Продемонстрировать процедуру будет Джоани Райан, бывшая аспирантка нашей лаборатории. Для начала подготовьте 100-килодальтонный центробежный фильтр с молекулярной массой, добавив полную объемную емкость PBS.Центрифуга в течение пяти минут при 2, 800 раз G при 4 градусах Цельсия. Отбросьте проточное прохождение и все оставшиеся PBS и заполните камеру отбора проб Mtb CFP до максимальной емкости. Центрифуга в 2 800 раз G при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства.Повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока весь образец не будет достаточно уменьшен. Добавьте 1X PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите объем, как описано выше, и повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и буферную замену.Затем извлеките 100-килодальтонный концентрированный кретентат CFP или 100R в соответствии со спецификациями ультрафильтрационного устройства. Промывайте фильтр с минимальным объемом 1X PBS не менее трех раз и потяните мойку с помощью 100R, чтобы максимизировать восстановление. Используйте несколько разбавлений образцов в PBS и количественно оцените материал 100R с помощью бицинхонинового анализа.Протестируйте образец в трех экземплярах. Позвольте хроматографии исключения размера, или столбцу SEC, уравновеситься до комнатной температуры. Включите AFC с помощью выключателя питания на задней панели башенного блока и нажмите Setup на сенсорном экране главного меню, если это необходимо, чтобы настроить параметры для тензодатчика.На экране настройки выровняйте карусель, выбрав «Кольцевая галерея», а затем «Калибровка». Вставьте карусель с 13 небольшими отверстиями, обращенными вверх, в башню AFC и отрегулируйте карусель, нажав кнопки «минус» или «плюс» так, чтобы сопло жидкости находилось непосредственно над положением заподлицо. Снимите колпачки с уравновешенного столбца SEC и переместите столбец SEC в соответствующее крепление столбца.Аккуратно установите его на башню AFC. Убедитесь, что метка радиочастотной идентификации на колонне обращена к AFC, и убедитесь, что соединение между колонкой и клапаном надежно. Поместите выпускную трубку для отходов в контейнер для сбора.На экране настройки выберите Расписание сбора и установите число 13, а размер 0,5 миллилитра, нажав кнопки минус или плюс. Оставьте значение громкости буфера равным по умолчанию 2,7 миллилитра и закройте окно расписания сбора. Выберите Запустить коллекцию на начальном экране и подтвердите параметры коллекции, нажав кнопку Да.Груз 13 маркированных 1,7-миллилитровых микроцентрифужных трубок с открытыми крышками и направленными в сторону центра карусели. Переместите AFC, выбрав OK, затем смонтируйте резервуар колонны и снова нажмите OK. Выберите параметр для очистки столбца, нажав кнопку Да, и добавьте один столбец с фильтром PBS 0,2 микрометра, чтобы удалить любой буфер хранения. Как только промывка будет завершена, переместите AFC, нажав OK. Поместите крышку карусели на AFC и нажмите OK. Используйте пипетку, чтобы удалить лишний буфер из столбца.Доведите три миллиграмма образца 100R до 500 микролитров с 1X PBS и добавьте образец в верхнюю часть столбца. Подготовьте один столбец объемом 0,2 микрометра с фильтром PBS. Раздвиньте AFC и позвольте образцу врезаться в лад.После того, как образец полностью вошел в колонну, добавьте pBS, подготовленный ранее, в резервуар. Следите за выполнением AFC, пока он собирает сначала объем пустоты, а затем указанные фракции. После того, как пробег завершится и карусель вернется в исходное положение, снимите крышку и дробные трубки с карусели.Для фракций размером 0,5 миллиметра, собранных из трех миллиграммов 100R Mtb CFP, измерьте концентрацию белка с использованием микро-BCA с разведением 1:3 для фракций, пронумерованных от 1 до 7 каждого образца в трех экземплярах. Для фракций 0,5 миллилитра, пронумерованных от 5 до 13, используйте BCA без разбавления для каждого образца в трех экземплярах. Добавьте буфер образцов SDS к 10 микролитрам каждой фракции и пяти микрограммам CFP и 100R.Кипятить в течение пяти минут при 100 градусах Цельсия. Затем нагрузите гель от 4 до 12% Bis-Tris с лестницей молекулярной массы для электрофореза полиакриламидного геля или PAGE. Запустите гель SDS-PAGE, используя 1X MES рабочий буфер и ток 200 В в течение 35 минут.Извлеките гель из кассеты и примените 50-вольтовый ток в течение как минимум одного часа, чтобы перенести разрешенные белки на 0,2-микрометровую нитроцеллюлозную мембрану. Наконец, выполните анализ вестерн-блоттинга для оценки белков. Гель SDS-PAGE, окрашенный серебром, демонстрирует общий профиль белка для каждой фракции.Данные показывают, что более поздние фракции содержат больше белка и напоминают материал 100R. Вестерн-блоты, обнаруживающие LAM, LpqH и GroES, демонстрируют, что белковые маркеры изменяются во всех фракциях. Здесь показана просвечивающая электронная микроскопия, или изображения ТЭМ, фракций SEC от 1 до 3, вытянутых перед фиксацией.Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было отрицательно окрашено для визуализации TEM. Здесь показан анализ отслеживания наночастиц, или распределение NTA, фракций SEC от 1 до 3. Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было проанализировано с помощью анализа отслеживания наночастиц, и распределение размеров отображается здесь.Этот протокол был оптимизирован для очистки EV от трех миллиграммов 100R. Если белковая нагрузка варьируется, рекомендуемая стратегия разбавления и BCA на полученных фракциях может потребовать корректировки. Mtb EV, приготовленные с помощью этого метода, могут быть использованы для последующих композиционных и омических исследований.Они также подходят для экспериментов in vitro и in vivo. Этот метод обеспечивает легкий и эффективный способ производства высококачественных препаратов Mtb EV, прокладывая путь для повышения воспроизводимости в будущих экспериментах Mtb EV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Пример подготовки<em&gt; Микобактерий туберкулеза</em&gt; Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Роман микродиссекция подход к Восстановление<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Конкретные Стенограммы из фиксированных формалином и залитые парафином легких гранулемы

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...