Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
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Nos gustaría agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Biomédicas Premio Experiencial y el Programa de Investigación Compartida del Consejo de Investigación Universitaria a NKG y la financiación de ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. También nos gustaría agradecer a Anne Simpson por su apoyo técnico y a BEI Resources, NIAID, NIH por los siguientes reactivos: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producido in vitro), NR-49223, y Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clon CS-35 (producido in vitro), NR-13811.

El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el pr...

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	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas 4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados8. Si bien este proceso es efecti...

La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año2. La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infección 3,4,5. Los esfuerzos para comprender la composición de los EV Mtb revelaron esferas encerradas en la membrana lipídica de 50-150 nm derivadas de la membrana plasmática que contienen lípidos y proteínas de importancia inmunológica 3,6. La investigación del papel de los EV Mtb en la fisiología bacteriana ha revelado la importancia de la modulación bacteriana ev en respuesta al estrés ambiental para la supervivencia5. Los estudios de interacción huésped-patógeno han sido más complicados de interpretar, pero la evidencia indica que los EV Mtb pueden influir en la respuesta inmune del huésped y pueden servir potencialmente como un componente de vacunación efectivo 3,4,7.
La mayoría de los estudios de EV Mtb hasta ahora se han basado en la ultracentrifugación por gradiente de densidad para el enriquecimiento de vesículas8. Esto ha sido eficaz para los estudios a pequeña escala; sin embargo, esta técnica tiene varios desafíos técnicos y logísticos. Los flujos de trabajo alternativos combinan la centrifugación de varios pasos, para la eliminación de células enteras y escombros grandes, con un paso final de ultracentrifugación para granular evs. Esta metodología puede variar en eficiencia y, a menudo, da como resultado un bajo rendimiento y copurificación de biomoléculas solubles asociadas a vesículas no vesículas, al tiempo que afecta la integridad de las vesículas9. Además, este proceso requiere mucho tiempo, es intensivo manualmente y tiene un rendimiento muy limitado debido a las limitaciones del equipo.
El presente protocolo describe una técnica alternativa a la ultracentrifugación por gradiente de densidad: la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Este método ha sido demostrado para micobacterias ambientales, y en el trabajo actual, se ha extrapolado a Mtb10. Una columna disponible comercialmente y un colector automático de fracción pueden mejorar la consistencia en la preparación vesical y reducir la necesidad de equipos específicos y costosos. También es posible completar este protocolo en una fracción del tiempo en comparación con la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que aumenta el rendimiento. Esta técnica es menos desafiante técnicamente, por lo que es más fácil de dominar, y puede aumentar la reproducibilidad inter / intra-laboratorio. Finalmente, SEC tiene una alta eficiencia de separación y es suave, preservando la integridad de las vesículas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.

La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rango...

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Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Este protocolo reduce la complejidad técnica y el tiempo requerido para el enriquecimiento de vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Proporciona una alternativa suave a la ultracentrifugación tradicional y las técnicas basadas en la densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, por lo que es más reproducible.Proporciona un alto rendimiento de Mtb EVs con un mínimo co-enriquecimiento de proteínas no EV. Demostrando el procedimiento estará Joanie Ryan, una ex estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton agregando la capacidad de volumen total de PBS.Centrifugar durante cinco minutos a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados. Deseche el flujo continuo y cualquier PBS restante, y llene la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración.Repita según sea necesario hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente. Agregue 1X PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describió anteriormente y repita este paso cinco veces para garantizar el lavado completo y el intercambio de tampón.Luego, recupere el retentado CFP concentrado de 100 kilodalton o 100R, de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración. Lave el filtro con un volumen mínimo de 1X PBS al menos tres veces, y tire del lavado con el 100R para maximizar la recuperación. Utilice varias diluciones de muestras en PBS y cuantifique el material 100R con un ensayo bicinchonínico.Pruebe la muestra por triplicado. Permita que la cromatografía de exclusión de tamaño, o columna SEC, se equilibre a temperatura ambiente. Encienda el AFC con el interruptor de encendido situado en la parte posterior de la unidad de torre y pulse Setup (Configuración) en la pantalla táctil del menú principal si es necesario para ajustar los ajustes de la célula de carga.En la pantalla de configuración, alinee el carrusel seleccionando Carrusel seguido de Calibrar. Inserte el carrusel con los 13 orificios pequeños hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel presionando los botones menos o más para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga. Retire las tapas de la columna SEC equilibrada y deslice la columna SEC en el soporte de columna adecuado.Instálelo cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recolección.En la pantalla de configuración, seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 mililitros presionando los botones menos o más. Deje la configuración de volumen de búfer como predeterminada de 2,7 mililitros y, a continuación, cierre la ventana de programación de recogida. Seleccione Iniciar recopilación en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de recopilación seleccionando Sí.Load 13 etiquetado como tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel. Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando Sí y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK. Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.Lleve tres miligramos de muestra 100R a 500 microlitros con 1X PBS y agregue la muestra a la parte superior de la columna. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros. Avance el AFC y permita que la muestra se ejecute en el traste.Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado anteriormente al depósito. Supervise la ejecución del AFC mientras recopila primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Después de que se complete la ejecución y el carrusel vuelva a la posición de desecho, retire la cubierta y los tubos de fracción del carrusel.Para fracciones de 0,5 milímetros recogidas de tres miligramos de 100R Mtb CFP, medir la concentración de proteína utilizando el micro-BCA con una dilución 1:3 para fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado. Para fracciones de 0,5 mililitros numeradas del 5 al 13, use el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado. Agregue el tampón de muestra SDS a 10 microlitros de cada fracción y cinco microgramos de CFP y 100R.Hervir durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Luego cargue en un gel de 4 a 12% de Bis-Tris con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida, o PAGE. Ejecute un gel SDS-PAGE utilizando un búfer de funcionamiento MES 1X y una corriente de 200 voltios durante 35 minutos.Retire el gel del casete y aplique una corriente de 50 voltios durante un mínimo de una hora para transferir las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 micrómetros. Finalmente, realice el análisis de Western blot para evaluar las proteínas. Un gel SDS-PAGE teñido con plata demuestra el perfil proteico general para cada fracción.Los datos muestran que las fracciones posteriores contienen más proteínas y se asemejan al material 100R. Los Western blots que detectan LAM, LpqH y GroES demuestran que el marcador de proteínas cambia a través de las fracciones. Aquí se muestra la microscopía electrónica de transmisión, o imágenes TEM, de las fracciones SEC 1 a 3 extraídas antes de la fijación.La ultracentrifugación por gradiente de densidad de los EV Mtb se tiñó negativamente para las imágenes TEM. El análisis de seguimiento de nanopartículas, o distribución NTA, de las fracciones SEC 1 a 3 se muestra aquí. Los EV de ultracentrifugación de gradiente de densidad Mtb se analizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, y la distribución de tamaño se muestra aquí.Este protocolo ha sido optimizado para la purificación de EV a partir de tres miligramos de 100R. Si la carga proteica es variada, la dilución recomendada y la estrategia de BCA en las fracciones resultantes pueden requerir ajustes. Los EV de MTB preparados con esta técnica se pueden utilizar para estudios posteriores basados en la composición y ómicas.También son adecuados para experimentos in vitro e in vivo. Esta técnica proporciona una forma fácil y eficiente de producir preparaciones de Mtb EV de alta calidad, allanando el camino para una mayor reproducibilidad en futuros experimentos de Mtb EV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

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Investigación

Inmunología e Infección

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Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...