Name: mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Vi vill erkänna stöd från College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award och College Research Council Shared Research Program till NKG och finansiering av ATCC (utmärkelse # 2016-0550-0002) till KMD. Vi vill också tacka Anne Simpson för teknisk support och BEI Resources, NIAID, NIH för följande reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producerad in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producerad in vitro), NR-49223 och Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (producerad in vitro), NR-13811.

Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkände denna studie (19-046B). Odling av Mycobacterium tuberculosis och skörd av EV-rika kultursupnatanter utfördes av utbildad personal i ett laboratorium med hög inneslutning. Materialen flyttades ut från området med hög inneslutning efter att en giltig inaktiveringsmetod utfördes, bekräftades och godkändes av institutionella biosäkerhetspolicyer. Om validerad inaktivering eller steril filtreringsmetod inte är möjlig måste följande pr...

<ol>
	<li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond.">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021.">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis.">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition.">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quir&#243;s, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+mycobacteria.">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li><li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins.">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li><li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly.">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li><li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes.">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).</li><li>. Production Manuals &amp; SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022)</li><li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies.">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li><li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains.">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection.">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li><li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans:+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker.">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li><li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome.">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li></ol>

Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar är mycket antigena reservoarer, som presenterar dem som en attraktiv väg för att utveckla diagnostiska verktyg och framtida vacciner 4,19,20. Historiskt sett har ultracentrifugering av densitetsgradient använts för att separera Mtb-elbilar från annat lösligt, utsöndrat material8. Även om denna process är effektiv är den också tidskr?...

Extracellulär vesikel (EV) frisättning av patogener kan vara nyckeln till att låsa upp ny teknik för att kontrollera infektionssjukdomar1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) är en patogen med hög konsekvens, som infekterar ungefär en tredjedel av världens befolkning och kräver miljontals människors liv varje år2. EV-produktion av Mtb är väldokumenterad men ändå svårfångad i biogenesen och varierade roller (dvs. immunstimulerande, immunsuppressiv, järn- och näringsförvärv) för dessa elbilar i samband med infektion 3,4,5. Ansträngningar för att förstå sammansättningen av Mtb-elbilar avslöjade 50-150 nm lipidmembranslutna sfärer härledda från plasmamembranet innehållande lipider och proteiner av immunologisk betydelse 3,6. Undersökning av Mtb EV: s roll i bakteriell fysiologi har avslöjat vikten av bakteriell EV-modulering som svar på miljöstress för överlevnad5. Värd-patogeninteraktionsstudier har varit mer komplicerade att tolka, men bevis tyder på att Mtb-elbilar kan påverka värdens immunsvar och potentiellt kan fungera som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De flesta studier av Mtb-elbilar hittills har förlitat sig på ultracentrifugering av densitetsgradient för vesikelanrikning8. Detta har varit effektivt för småskaliga studier; denna teknik har dock flera tekniska och logistiska utmaningar. Alternativa arbetsflöden kopplar samman flerstegscentrifugering, för avlägsnande av hela celler och stora skräp, med ett sista ultracentrifugeringssteg för att pellet-elbilar. Denna metod kan variera i effektivitet och resulterar ofta i lågt utbyte och samrening av lösliga icke-vesikelassocierade biomolekyler samtidigt som det påverkar vesikelintegriteten9. Dessutom är den här processen tidskrävande, manuellt intensiv och mycket begränsad i genomströmning på grund av utrustningsbegränsningar.
Det nuvarande protokollet beskriver en alternativ teknik till ultracentrifugering av densitetsgradient: storleksuteslutningskromatografi (SEC). Denna metod har demonstrerats för miljömykobakterier, och i det aktuella arbetet har den extrapolerats till Mtb10. En kommersiellt tillgänglig kolonn och automatisk fraktionsuppsamlare kan förbättra konsistensen vid vesikal beredning och minska behovet av specifik, dyr utrustning. Det är också möjligt att slutföra detta protokoll på en bråkdel av tiden jämfört med ultracentrifugering av densitetsgradient, vilket ökar genomströmningen. Denna teknik är mindre tekniskt utmanande, vilket gör det lättare att behärska och kan öka reproducerbarheten mellan / inom laboratorier. Slutligen har SEC hög separationseffektivitet och är skonsam, vilket bevarar vesiklarnas integritet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x MES SDS Running Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>AFC-V1-USD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10748010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra 6R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>Ultrafiltration device used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotting System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-528-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grade Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF200H-Cu-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab6790</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-49223</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13792</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13811</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoClean 1070</td>
			<td>Fischione Instruments</td>
			<td></td>
			<td>For plasma cleaning of the TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &#956;m</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV Original 35 nm 5/pk</td>
			<td>IZON Science</td>
			<td>SP5-USD</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1112</td>
			<td>In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel chamber</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmafast BCIP/NBT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610449</td>
			<td>In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle enrichment through size exclusion chromatography

Rollen av extracellulära vesiklar (EV) i samband med bakteriell infektion har dykt upp som en ny väg för att förstå mikrobiell fysiologi. Specifikt spelar Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbilar en roll i värd-patogeninteraktionen och svaret på miljöstress. Mtb elbilar är också mycket antigena och visar potential som vaccinkomponenter. Den vanligaste metoden för att rena Mtb elbilar är densitetsgradient ultracentrifugering. Denna process har flera begränsningar, inklusive låg genomströmning, lågt utbyte, beroende av dyr utrustning, tekniska utmaningar och det kan påverka den resulterande förberedelsen negativt. Storleksuteslutningskromatografi (SEC) är en mildare alternativ metod som bekämpar många av begränsningarna för ultracentrifugering. Detta protokoll visar att SEC är effektivt för Mtb EV-anrikning och producerar högkvalitativa Mtb EV-preparat med ökat utbyte på ett snabbt och skalbart sätt. Dessutom visar en jämförelse med ultracentrifugering av densitetsgradient genom kvantifierings- och kvalificeringsförfaranden fördelarna med SEC. Medan utvärderingen av EV-kvantitet (nanopartikelspårningsanalys), fenotyp (transmissionselektronmikroskopi) och innehåll (Western blotting) är skräddarsydd för Mtb-elbilar, kan arbetsflödet som tillhandahålls tillämpas på andra mykobakterier.

Odlingsfiltratprotein (CFP) från Mycobacterium tuberculosis (Mtb) koncentrerades, kvantifierades och sedan applicerades 3 mg material på en storleksuteslutningskromatografikolonn (SEC). Protein- och partikelkoncentrationerna räknades upp av BCA respektive NTA. Förväntade intervall för protein- och partikelåtervinning plus de exakta värden som erhållits för dessa resultat rapporteras i tabell 1. Värden som är mycket högre än dessa intervall kan tyda på problem med kontaminering ell...

Watch this Scientific Journal Video about Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Detta protokoll beskriver storleksuteslutningskromatografi, en enkel och reproducerbar teknik för att berika Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar från kultursupnatanter.

Mycobacterium tuberkulos Extracellulär vesikelanrikning genom storleksuteslutningskromatografi

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Detta protokoll minskar den tekniska komplexiteten och tiden som krävs för anrikning av extracellulära vesiklar från Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV. Det ger ett skonsamt alternativ till traditionella ultracentrifugerings- och densitetsbaserade tekniker. Den största fördelen med denna teknik är att den är lätt att utföra, vilket gör den mer reproducerbar.Det ger ett högt utbyte av Mtb-elbilar med minimal icke-EV-proteinanrikning. Demonstrerar proceduren kommer att vara Joanie Ryan, en tidigare doktorand i vårt labb. För att börja, förbered ett 100 kilodalton molekylvikt cutoff centrifugalfilter genom att lägga till PBS fulla volymkapacitet.Centrifugera i fem minuter vid 2 800 gånger G vid 4 grader Celsius. Kassera genomströmningen och eventuell återstående PBS och fyll provkammaren med Mtb CFP till dess maximala kapacitet. Centrifugera vid 2 800 gånger G vid 4 grader Celsius tills volymen har minskat till ultrafiltreringsanordningens minsta volym.Upprepa vid behov tills hela provet har reducerats tillräckligt. Tillsätt 1X PBS till filterenheten som innehåller koncentratet upp till den totala enhetskapaciteten. Minska volymen enligt beskrivningen ovan och upprepa detta steg fem gånger för att säkerställa fullständig tvätt och buffertutbyte.Återvinn sedan den 100 kilodalton koncentrerade CFP-retentaten eller 100R, enligt specifikationerna för ultrafiltreringsanordningen. Tvätta filtret med en minimal volym på 1X PBS minst tre gånger och dra tvätten med 100R för att maximera återhämtningen. Använd flera utspädningar av prover i PBS och kvantifiera 100R-materialet med en bicinchoninisk analys.Testa provet i tre exemplar. Låt storleksuteslutningskromatografin, eller SEC-kolumnen, balansera till rumstemperatur. Slå på AFC med strömbrytaren på baksidan av tornenheten och tryck på Setup på huvudmenyns pekskärm om det behövs för att justera inställningarna för lastcellen.På inställningsskärmen justerar du karusellen genom att välja Carousel följt av Calibrate. Sätt i karusellen med de 13 små hålen uppåt i AFC-tornet och justera karusellen genom att trycka på minus- eller plusknapparna så att vätskemunstycket är direkt ovanför spolläget. Ta bort locken från den utjämnade SEC-kolumnen och skjut SEC-kolumnen till lämplig kolumnfäste.Installera den försiktigt på AFC-tornet. Se till att radiofrekvensidentifieringstaggen på kolumnen vetter mot AFC och kontrollera att anslutningen mellan kolonnen och ventilen är säker. Placera avfallsutloppsslangen i en uppsamlingsbehållare.På inställningsskärmen väljer du Samlingsschema och ställer in antalet till 13 och storleken till 0,5 ml genom att trycka på minus- eller plusknapparna. Lämna buffertvolyminställningen som standard på 2,7 ml och stäng sedan fönstret för insamlingsschema. Välj Starta samling på startskärmen och bekräfta samlingsparametrarna genom att välja Ja.Ladda 13 märkta 1,7 ml mikrocentrifugrör med locken öppna och pekande mot karusellcentret. Avancera AFC genom att välja OK, montera sedan kolumnbehållaren och avancera igen genom att trycka på OK. Välj alternativet för att spola kolumnen genom att trycka på Ja och lägg till en kolumnvolym på 0,2 mikrometer filtrerad PBS för att ta bort eventuell lagringsbuffert. När spolningen är klar avancerar du AFC genom att trycka på OK. Placera karuselllocket över AFC och tryck på OK. Använd en pipett för att ta bort eventuell överskottsbuffert från kolonnen.Ta med tre milligram 100R-prov till 500 mikroliter med 1X PBS och tillsätt provet högst upp i kolonnen. Förbered en kolonnvolym på 0,2 mikrometer filtrerad PBS. Avancera AFC och låt provet rinna in i banden.När provet har gått in i kolumnen helt, lägg till PBS som beretts tidigare i behållaren. Övervaka körningen av AFC medan den samlar in först tomrumsvolymen och sedan de angivna fraktionerna. När körningen är klar och karusellen återgår till avfallsläget, ta bort locket och fraktionsrören från karusellen.För 0,5 millimeter fraktioner som samlats in från tre milligram 100R Mtb CFP, mät proteinkoncentrationen med hjälp av mikro-BCA med en utspädning på 1:3 för fraktioner numrerade 1 till 7 av varje prov i tre exemplar. För 0,5 ml fraktioner numrerade 5 till 13, använd BCA utan utspädning för varje prov i tre exemplar. Tillsätt SDS-provbuffert till 10 mikroliter av varje fraktion och fem mikrogram CFP och 100R.Koka i fem minuter vid 100 grader Celsius. Ladda sedan på en 4 till 12% Bis-Tris gel med en molekylviktstege för polyakrylamidgelelektrofores, eller PAGE. Kör en SDS-PAGE-gel med 1X MES-körbuffert och en 200-volts ström i 35 minuter.Ta bort gelén från kassetten och applicera en 50-volts ström i minst en timme för att överföra de upplösta proteinerna till ett 0,2 mikrometer nitrocellulosamembran. Slutligen utför Western blot-analysen för att utvärdera proteinerna. En SDS-PAGE-gel färgad med silver visar den totala proteinprofilen för varje fraktion.Data visar att de senare fraktionerna innehåller mer protein och liknar 100R-materialet. Western blots som detekterar LAM, LpqH och GroES visar att proteinmarkören förändras över fraktionerna. Transmissionselektronmikroskopi, eller TEM-bilder, av SEC-fraktioner 1 till 3 som dras före fixering visas här.Densitetsgradient ultracentrifugering av Mtb-elbilar färgades negativt för TEM-avbildning. Nanopartikelspårningsanalysen, eller NTA-fördelningen, av SEC-fraktionerna 1 till 3 visas här. Densitetsgradient ultracentrifugering Mtb EVs analyserades med nanopartikelspårningsanalys, och storleksfördelningen visas här.Detta protokoll har optimerats för EV-rening från tre milligram 100R. Om proteinbelastningen varierar kan den rekommenderade utspädnings- och BCA-strategin för resulterande fraktioner kräva justering. Mtb-elbilar framställda med denna teknik kan användas för nedströms kompositions- och omics-baserade studier.De är också lämpliga för in vitro- och in vivo-experiment. Denna teknik ger ett enkelt och effektivt sätt att producera högkvalitativa Mtb EV-preparat, vilket banar väg för ökad reproducerbarhet i framtida Mtb EV-experiment.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Provberedning av<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakt för Nuclear Magnetic Resonance studier Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Tillväxt av Mycobacterium tuberculosis Biofilmer

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En experimentell modell för att studera Tuberculosis-Malaria Coinfection på Natural Överföring av Mycobacterium tuberculosis Och Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstration av en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection förhållningssätt till Återställa<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Särskilda Avskrifter från formalinfixerad paraffininbäddade Lung Granulom

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Human Lung Tissue Modell för funktionella studier på<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System för Efficacy och cytotoxicitet Screening av inhibitorer Inriktning Intracellulär<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

En hög kapacitet Kompatibel analys för att utvärdera läkemedlets effektivitet mot makrofag passe<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis hos möss med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Utvärdering av extracellulära vesikler funktion under malariainfektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...