Name: computer numerical control micromilling of a microfluidic acrylic device with a staggered restriction for magnetic nanoparticle-based immunoassays
Uploaded: 2022-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Conacyt, Messico sotto sovvenzione 312231 del "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", e da AMEXCID e dal Ministero delle Relazioni Estere del Messico (SRE) sotto la sovvenzione "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO ringrazia Conacyt Mexico per la borsa di studio di dottorato.

1. Microfresatura
<ol><li>Rettifica superficiale<ol><li>Accendere la microfresatrice e il controller piezoelettrico. Avviare i rispettivi software di controllo12.</li>
		<li>Selezionare le punte di fresa richieste (diametri 200 μm e 800 μm). Posizionarli nell'apposito vano della fresatrice (Figura 1).</li>
		<li>Tagliare rettangoli di 9 mm x 25 mm di PMMA di spessore 1,3 mm con la punta da 800 μm. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con n...

<ol>
	<li>Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoassays+in+microfluidic+systems.">Immunoassays in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).</li><li>Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microfluidic+technology+for+bioanalysis+and+diagnostics.">Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).</li><li>Teste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip+integrating+magnetic+nanoparticles+for+allergy+diagnosis.">Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis.</a> Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., S&#225;nchez-Dom&#237;nguez, M., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-nanoparticles+magnetic+trap:+Toward+high+sensitivity+and+rapid+microfluidic+continuous+flow+enzyme+immunoassay.">Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay.</a> Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).</li><li>Khizar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles+in+microfluidic+and+sensing:+From+transport+to+detection.">Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection.</a> Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).</li><li>Podaru, G., Chikan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAPTER+1:+Magnetism+in+nanomaterials:+Heat+and+force+from+colloidal+magnetic+particles.">CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles.</a> Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , 1-24 (2017).</li><li>Reynoso-Hern&#225;ndez, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+efficiency+of+magnetic+nanoparticles+through+the+compaction+effect+of+a+microparticles+column.">Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column.</a> Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).</li><li>Gale, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+methods+in+microfluidic+device+fabrication+and+future+commercialization+prospects.">A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects.</a> Inventions. 3 (3), 60 (2018).</li><li>Liu, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+microfluidic+devices+and+their+applications+in+protein+and+DNA+analysis.">Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis.</a> Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).</li><li>Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromilling:+A+method+for+ultra-rapid+prototyping+of+plastic+microfluidic+devices.">Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., Jim&#233;nez-Vald&#233;s, R. J., Garc&#237;a-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-actuated+monolithic+acrylic+microfluidic+valves+and+pumps.">Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps.</a> Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+affordable+3D-printed+positioner+fixture+improves+the+resolution+of+conventional+milling+for+easy+prototyping+of+acrylic+microfluidic+devices.">An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).</li><li>Friedrich, C. R., Vasile, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+micromilling+process+for+high-aspect-ratio+microstructures.">Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).</li><li>Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+different+materials+response+in+micro+milling+using+four+edged+micro+end+mill+tools.">Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools.</a> Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+low-cost+microfabrication+approach+for+polymethylmethacrylate,+polystyrene,+polycarbonate+and+polysulfone+based+microdevices.">A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices.</a> RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).</li><li>Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-pressure,+high-temperature+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices+and+their+applications+for+electrophoretic+separation.">Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).</li><li>Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+bonding+of+PMMA+and+COC+microfluidic+substrates+using+UV/ozone+surface+treatment.">Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).</li><li>Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+simple+and+fast+thermally-solvent+assisted+method+to+bond+PMMA-PMMA+in+micro-fluidics+devices.">A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).</li><li>Ogilvie, I. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+surface+roughness+for+optical+quality+microfluidic+devices+in+PMMA+and+COC.">Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).</li></ol>

Un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici utilizzando nanoparticelle come supporto immunologico è stato fabbricato utilizzando una tecnica di microfresatura. Il metodo di produzione diretta sul substrato ha il vantaggio di evitare l'utilizzo di uno stampo master e i tempi e i costi che questo comporta. Tuttavia, è limitato alla prototipazione rapida e alla produzione di dispositivi ad alto volume.
Qui, abbiamo utilizzato una piattaforma piezoelettrica accessoria precedente...

Negli ultimi anni, la microfluidica ha svolto un ruolo importante nelle tecniche di dosaggio immunologico1. La tecnologia di miniaturizzazione presenta molti vantaggi eccezionali rispetto ai test immunologici tradizionali, come il ridotto consumo di campioni e reagenti, tempi di incubazione più brevi, uno scambio efficiente di soluzioni e una maggiore integrazione e automazione2.
Inoltre, i sistemi microfluidici nei saggi immunologici, in associazione con nanoparticelle magnetiche come immunosupporto, riducono considerevolmente i tempi di incubazione, raggiungendo un'elevata sensibilità di rivelazione grazie all'aumento del rapporto superficie-volume3. Il movimento browniano delle particelle migliora la cinetica di reazione durante la formazione del complesso antigene-anticorpo 4,5. Inoltre, le proprietà magnetiche delle nanoparticelle forniscono la versatilità per essere integrate in diverse configurazioni di dispositivi microfluidici, rendendole un candidato ideale per la segnalazione e la cattura di molecole in sistemi di biorilevamento miniaturizzati su chip5. Tuttavia, le forze magnetiche sono significativamente più deboli delle forze di trascinamento su scala nanometrica a causa dell'elevato rapporto superficie-volume6. Pertanto, la cattura di nanoparticelle per fasi cruciali del dosaggio immunologico come il lavaggio e il rilevamento può essere difficile e un magnete convenzionale è insufficiente4.
Un modo efficace per manipolare le nanoparticelle è l'uso di una trappola magnetica microfluidica formata da microparticelle di ferro, che sono impacchettate in una struttura microfluidica3. Pertanto, quando un magnete esterno si avvicina, viene creata un'interazione complessa all'interno del mezzo poroso magnetizzato tra le forze magnetiche e di flusso. La forza magnetica che agisce sulle nanoparticelle è abbastanza forte da catturarle e resistere alla resistenza del flusso 3,4,7. Questo approccio richiede tecniche di microfabbricazione che raggiungano risoluzioni dell'ordine di pochi micrometri per generare strutture micrometriche che trattengano le microparticelle.
Le attuali tecniche di microfabbricazione consentono la fabbricazione ad alta risoluzione di strutture da pochi micron a centinaia di nanometri8. Tuttavia, molte di queste tecniche richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate. Una delle principali difficoltà è la necessità di una camera bianca per la fabbricazione di stampi, che rimane costosa e dispendiosa in termini di tempo 8,9. Recentemente, gli ingegneri microfluidici hanno superato questo inconveniente sviluppando una varietà di metodi di fabbricazione alternativi, con vari vantaggi come costi ridotti, tempi di consegna più rapidi, materiali e strumenti più economici e maggiore funzionalità8. In questo modo, lo sviluppo di nuove tecniche di microfabbricazione ha portato metodi a basso costo, non per camere bianche, che raggiungono risoluzioni fino a 10 μm8. La modellazione può essere utilizzata direttamente su un substrato senza generare un costoso modello di stampaggio, evitando così un processo dispendioso in termini di tempo. I metodi di fabbricazione diretta includono la fresatura CNC, l'ablazione laser e la litografia diretta8. Tutti questi metodi sono adatti per produrre canali ad alto rapporto di aspetto in una vasta gamma di materiali, indipendentemente dalla loro durezza9, consentendo nuove e vantaggiose geometrie, comportamenti fisici e qualità nei dispositivi microfluidici8.
La microfresatura CNC crea strutture su microscala utilizzando utensili da taglio che rimuovono materiale sfuso da un substrato ed è un metodo di fabbricazione efficace per dispositivi microfluidici10,11. La tecnica di microfresatura può essere utile nelle applicazioni microfluidiche per creare microcanali e caratteristiche direttamente sul piano di lavoro, offrendo un vantaggio chiave: un pezzo può essere fabbricato in breve tempo (meno di 30 minuti), riducendo significativamente i tempi di consegna dalla progettazione al prototipo12. Inoltre, l'ampia disponibilità di accessori da taglio di diversi materiali, dimensioni e forme rende le fresatrici CNC uno strumento adatto che ha permesso la fabbricazione di diverse caratteristiche in molti tipi di materiali usa e getta a basso costo13.
Tra tutti i materiali comunemente utilizzati nella microfresatura, i termoplastici rimangono una scelta leader grazie alle loro numerose proprietà favorevoli e alla compatibilità con le applicazioni biologiche10,14. I materiali termoplastici sono un substrato interessante per i sistemi microfluidici grazie ai loro significativi vantaggi per lo sviluppo di sistemi analitici monouso a basso costo9. Inoltre, questi materiali sono altamente suscettibili ai processi di produzione ad alto volume, rendendoli adatti alla commercializzazione e alla produzione di massa. Per questi motivi, i materiali termoplastici come il PMMA sono stati considerati materiali affidabili e robusti fin dai primi anni della microfluidica10. Sono stati descritti diversi protocolli per fabbricare canali chiusi in materiali termoplastici, come il legame solvente15, il legame termico16 e l'incollaggio con trattamento superficiale ultravioletto (UV) / ozono17.
In molti casi, la risoluzione di posizionamento ottenuta con le microfresatrici convenzionali non è sufficiente per alcune applicazioni microfluidiche che richiedono strutture inferiori a 10 μm. La microfresatura di fascia alta ha una risoluzione sufficiente. Sfortunatamente, a causa dei prezzi elevati, il suo utilizzo è limitato a una manciata di utenti12. In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha riportato la fabbricazione e la manipolazione di uno strumento a basso costo che consente di lavorare strutture inferiori a 10 μm, superando la risoluzione delle fresatrici convenzionali12. L'apparecchio è una piattaforma prodotta dalla stampa 3D con elettronica semplice, contenente tre attuatori piezoelettrici. La superficie contiene giunti a cerniera che consentono di sollevarla quando gli elementi piezoelettrici agiscono simultaneamente. Lo spostamento dell'asse Z può essere controllato con una risoluzione di 500 nm e una precisione di ±1,5 μm12.
Questo documento presenta le fasi del processo di produzione di un dispositivo acrilico (PMMA) attraverso una tecnica di microfresatura. Il design del chip è costituito da un canale principale largo 200 μm e alto 200 μm e da un canale laterale con le stesse dimensioni per spurgare il flusso dei reagenti. Nella regione centrale, il canale è interrotto da una restrizione fisica di soli 5 μm di altezza, fabbricata con la piattaforma piezoelettrica stampata in 3D realizzata da questo gruppo12, per catturare le microparticelle magnetiche che costituiscono una trappola magnetica per le nanoparticelle posizionando un magnete esterno. Mostriamo il funzionamento del dispositivo microfluidico eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo combina diverse caratteristiche che lo rendono unico4: l'uso di nanoparticelle magnetiche come supporto immunitario riduce il tempo totale di test da ore a minuti; l'utilizzo di un enzima fluorogenico per la rilevazione consente limiti di rilevazione paragonabili a quelli dei saggi standard di immunoassorbimento enzimatico (ELISA); e l'uso di un termoplastico come materiale di fabbricazione lo rende compatibile con la produzione di massa, cosa che non era il caso delle precedenti trappole magnetiche di nanoparticelle microfluidiche3, e lo rende un ottimo candidato per sviluppare POCT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.008 Endmill</td>
			<td>KYOCERA SGS&#160;</td>
			<td>2204</td>
			<td>2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.032 Endmill</td>
			<td>KYOCERA SGS&#160;</td>
			<td>2228</td>
			<td>2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl-iron microparticles&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td>7 &#956;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fermont</td>
			<td>6201</td>
			<td>Health Hazard: Moderate 
			Flammability: None 
			Reactivity: None 
			Contact Hazard: Moderate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Moment</td>
			<td>Teledyne Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Sensor Technology: CMOS 
			Quantum Efficiency: 73% 
			Pixel Size: 4.5 &#181;m x 4.5 &#181;m 
			Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Engrave Software</td>
			<td>Roland DGA Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Engraving software to design and create the engraving path on the surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction hood</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Plastic Tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>ID = 0.020, OD = 0.060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microsope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Dispense Needle</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>98612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade piezoelectric controller application</td>
			<td>LabView&#160;</td>
			<td></td>
			<td>See reference 12 for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 495 instant adhesive</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>49503</td>
			<td>Apply with micropipette tip or dispensing needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack</td>
			<td>thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td>12 x 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanic press</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling Machine</td>
			<td>Roland</td>
			<td>MDX-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric platform&#160;</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>See reference 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>ME303018/1</td>
			<td>Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVCamTest software</td>
			<td>Teledyne Photometrics</td>
			<td>Version 3.10.107&#160;</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 7457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMag Carboxyl Beads</td>
			<td>Ocean NanoTech</td>
			<td>KSC0100</td>
			<td>100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>&#160;KDS200</td>
			<td>Can hold up to two syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrasonic bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPanel software&#160;</td>
			<td>Windows OS</td>
			<td>Version 1.0.3.0</td>
			<td>Software for controlling the micromilling machine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computer numerical control micromilling of a microfluidic acrylic device with a staggered restriction for magnetic nanoparticle-based immunoassays

I sistemi microfluidici hanno notevolmente migliorato le tecniche di dosaggio immunologico. Tuttavia, molte tecniche di microfabbricazione richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate, rendendo la fabbricazione costosa e incompatibile con la produzione di massa, che è una delle precondizioni più importanti per l'adozione di test point-of-care (POCT) in ambienti con risorse limitate. Questo lavoro descrive il processo di fabbricazione di un dispositivo acrilico (polimetilmetacrilato, PMMA) per test immunologici enzimatici coniugati con nanoparticelle utilizzando la tecnica di microfresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Il funzionamento del dispositivo microfluidico è dimostrato eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo integra una restrizione fisica sfalsata di soli 5 μm di altezza, utilizzata per catturare le microparticelle magnetiche che compongono una trappola magnetica posizionando un magnete esterno. In questo modo, la forza magnetica sul supporto immunologico delle nanoparticelle coniugate è sufficiente per catturarle e resistere alla resistenza del flusso. Questo dispositivo microfluidico è particolarmente adatto per la produzione di massa a basso costo senza perdita di precisione per le prestazioni del dosaggio immunologico.

È stato possibile stabilire un protocollo di fabbricazione altamente riproducibile che migliora la risoluzione della tecnica di microfresatura convenzionale. Utilizzando questo protocollo, si ottiene la fabbricazione di un canale di soli 5 μm di altezza che funziona come una restrizione sfalsata in un canale alto 200 μm. Il design semplice della restrizione sfalsata cattura microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro che, una volta compattate nel microcanale, consentono la creazione di una trappola magnetica quand...

Watch this Scientific Journal Video about Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays at JoVE.com

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

La microfluidica è un potente strumento per lo sviluppo di test diagnostici. Tuttavia, sono spesso necessarie attrezzature e materiali costosi, nonché laboriose tecniche di fabbricazione e manipolazione. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici magnetici basati su micro e nanoparticelle in un ambiente a basso costo e semplice da usare.

Microfresatura a controllo numerico computerizzato di un dispositivo acrilico microfluidico con restrizione sfalsata per saggi immunologici magnetici basati su nanoparticelle

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

Il nostro protocollo descrive un metodo di microfresatura ad alta risoluzione per fabbricare un dispositivo microfluidico acrilico per la rilevazione quantitativa di concentrazioni di analiti paragonabile alla tecnica ELISA gold standard. Il clou è la fabbricazione di un dispositivo microfluidico termoplastico semplice e a basso costo senza camera bianca, che consente tempi di analisi più brevi e buoni limiti di rilevamento in modo quantitativo. Inizia con la rettifica superficiale.Tagliare rettangoli 9 x 25 millimetri di PMMA di spessore 1,3 millimetri con la punta da 800 micrometri. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con nastro biadesivo alla piattaforma piezoelettrica. Collegare e posizionare il sensore Z sulla superficie del rettangolo PMMA.Selezionare il perno di rilevamento e spostarlo sulla superficie del sensore. Abbassare manualmente il perno senza contattare il sensore. Attivare la modalità di rilevamento Z-zero.Ruotare la punta della fresa da 200 micrometri a 14.500 giri / min. Abbassatelo lentamente fino alla coordinata di origine sull'asse z. Quindi reimpostare l'asse z 30 micrometri sotto l'origine.Impostate questa coordinata come nuova origine Z. Fare clic sul pulsante Taglia nel software della microfresatrice per attivare il pannello di taglio. Fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare il file TXT con un codice creato in precedenza per la levigatura della superficie acrilica.Fare clic sul pulsante Output per avviare il processo. Per la fresatura della restrizione di cinque micrometri, in primo luogo, impostare la velocità di rotazione della punta della fresa a 11.000 giri / min. Quindi, sollevare la piattaforma di 6,5 micrometri con l'interfaccia della piattaforma piezoelettrica.Spostate la punta della fresa lungo l'asse y di 500 micrometri. Riportare la piattaforma piezoelettrica al suo valore iniziale sull'asse z con l'interfaccia di controllo. Quindi, eseguire la fresatura dei microcanali aprendo il file di progettazione creato in precedenza dal software di progettazione.Fare clic sul pulsante Stampa, accedere al menu delle proprietà e fare clic sulla finestra dei colori corrispondente al livello contenente il disegno da lavorare. Impostate i parametri di fabbricazione nel pannello degli strumenti. Per la fresatura dei fori, passare alla punta da 800 micrometri.Attivate il livello di progettazione dei fori di 1,2 millimetri di diametro facendo clic sulla finestra di colore corrispondente e selezionando i parametri di fabbricazione corrispondenti. Lavorare due fori aggiuntivi sugli angoli controlaterali del rettangolo per l'allineamento dell'acrilico in modo invertito su una nuova piattaforma. Capovolgere l'acrilico e fissarlo con nastro biadesivo sopra l'adattatore con i pilastri lavorati.Aprire il file con il design dei fori per la faccia opposta rispetto al software di progettazione. Fresare la metà rimanente dei fori di ingresso e uscita del reagente con un diametro di 1,5 millimetri e una profondità di 0,7 millimetri. Pulire entrambi i fogli rettangolari acrilici con alcool isopropilico e risciacquare con acqua distillata.Immergere l'acrilico in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti. Asciugare entrambi i fogli acrilici e fissarli all'interno di un coperchio di piastra di Petri di vetro con nastro biadesivo. Quindi posizionare la base della capsula di Petri di vetro all'interno di una capsula di Petri di vetro più grande.Versare un millilitro di cloroformio nella base della piastra di Petri e posizionare rapidamente il coperchio con i fogli acrilici. Aggiungere immediatamente acqua distillata alla base della capsula di Petri più grande fino al livello del coperchio della capsula di Petri. Consentire l'esposizione dell'acrilico al gas cloroformio per un minuto.Quindi inclinare la capsula di Petri per rompere il sigillo dell'acqua e scoprire immediatamente la capsula di Petri. Per l'incollaggio, allineare entrambi gli acrilici con i lati esposti al cloroformio faccia a faccia e formare un sandwich. Posizionare gli acrilici nella pressa per due intervalli di due minuti, cambiando l'allineamento dell'acrilico.Quindi attaccare due o tre centimetri di tubo a ciascuno dei fori del dispositivo con adesivo liquido ad asciugatura istantanea. Riempire i canali con acqua distillata usando una siringa. Immergere il dispositivo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti.Quindi svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo e utilizzare una siringa per introdurre la soluzione al 5% di BSA. Preparare una sospensione di microparticelle di ferro di diametro a 7,5 micrometri in 5% BSA. Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno un'ora a temperatura ambiente.Quindi, inserire le microparticelle nel chip con un ago della siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale. Posizionare il chip verticalmente, quindi ruotare il chip in due passaggi di 90 gradi in modo che le microparticelle bersaglino e si compattano alla restrizione di cinque micrometri. Sigillare tutti i tubi del dispositivo acrilico con calore.Tagliare il tubo di ingresso fino a quando non rimangono solo pochi millimetri. Riempire l'ago di erogazione con tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo tagliato. Lasciare gocciolare la soluzione e quindi collegare l'ago al dispositivo.Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale, quindi collegarlo alla pompa della siringa. Quindi, ripetere la stessa procedura per il tubo di uscita del canale principale. Quindi collegare il chip al magnete.Per il rilevamento immunologico, mantenere il tampone di lavaggio in funzione per 10 minuti a 50 microlitri all'ora. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 50 microlitri della sospensione di nanoparticelle. Far scorrere la sospensione di nanoparticelle per sette minuti ad una portata di 100 microlitri all'ora.Quindi cambiare la portata a 50 microlitri all'ora e continuare il flusso per altri 15 minuti. Cambiare l'ago erogatore e far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti alla stessa velocità. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 100 microlitri di substrato fluorogenico.Regolare i parametri di portata e tempo per l'ingresso del substrato, la misurazione della fluorescenza e la fase di lavaggio. Attivare il flusso di ingresso del substrato fluorogenico per sei minuti a 50 microlitri all'ora. 15 secondi prima che il flusso del substrato si arresti, accendere la fluorescenza del microscopio.Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 secondi prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi. Fare clic sul pulsante Start del parametro della portata desiderata immediatamente dopo l'interruzione del lavaggio del substrato. Eseguire l'imaging per sei minuti a un fotogramma al secondo.Fare clic sul pulsante Start del flusso di lavaggio immediatamente dopo l'arresto del flusso di misurazione selezionato. Per il test immunologico sono state utilizzate nanoparticelle coniugate con lisozima e anticorpi secondari coniugati con ravanello di rafano. È stato osservato un aumento dell'intensità della fluorescenza per diverse concentrazioni di anticorpi primari confrontando le regioni prima e dopo la trappola, dimostrando che la variazione della fluorescenza del substrato è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'anticorpo primario.Per una data concentrazione di anticorpi primari, l'intensità della fluorescenza è stata tracciata in funzione del tempo a diverse portate del substrato fluorogenico. La capacità di conversione del substrato da parte dell'enzima HRP era inversamente proporzionale alla portata, è stata ottenuta un'intensità massima per una portata di un microlitro all'ora. Per le diverse portate per varie concentrazioni di anticorpi primari, le curve delle differenze di fluorescenza dopo e prima dell'immunoreazione hanno mostrato che per una concentrazione di 1.000 nanogrammi per millilitro, la fluorescenza satura per tutte le portate valutate.È stata preparata una curva di taratura utilizzando il valore massimo delle differenze di intensità di fluorescenza ottenute rispetto alla concentrazione di anticorpi primari per ciascuna portata. L'elevata variabilità e gli alti livelli di fluorescenza a un microlitro all'ora hanno suggerito che la velocità non favorisce il flusso del substrato reagente e tende ad accumularsi subito dopo la trappola. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alle fasi di sigillatura dei microcanali poiché l'esposizione al cloroformio è molto sensibile alla temperatura.Per risultati riproducibili, la temperatura deve essere sempre la stessa. Il nostro sistema aiuta a capire dove la compattezza e la dimensione delle microparticelle, la dimensione delle nanoparticelle, gli antigeni, gli anticorpi di rilevamento e il substrato sono fattori determinanti per il limite di rilevazione nel saggio immunologico microfluidico basato su nanoparticelle.

Research

JoVE Journal

Engineering

Terahertz Microfluidic Sensing Using a Parallel-plate Waveguide Sensor

Terahertz Sensing microfluidici Utilizzando un parallelo-piastra sensore guida d&#39;onda

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic ...

Ricerca

Ingegneria

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

Realizzazione di un interferometro di riferimento per Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

SSVEP-based Experimental Procedure for Brain-Robot Interaction with Humanoid Robots

SSVEP-based Procedura sperimentale per Brain-Robot Interaction con Humanoid Robots

Brain-Robot Interaction (BRI), which provides an innovative communication pathway between human and a robotic device via brain signals, is prospective in ...

Capillary-based Centrifugal Microfluidic Device for Size-controllable Formation of Monodisperse Microdroplets

Centrifuga dispositivo a microfluidi capillare a base per la Formazione Size-controllabile di Monodisperse microgocce

Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

Bonding solvente per la fabbricazione di PMMA e COP dispositivi microfluidici

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

Gain-compensation Methodology for a Sinusoidal Scan of a Galvanometer Mirror in Proportional-Integral-Differential Control Using Pre-emphasis Techniques

Metodologia Gain-risarcimento per una scansione sinusoidale di un galvanometro specchio in proporzionale-integrale-differenziale di controllo Utilizzando tecniche di pre-enfasi

Galvanometer mirrors are used for optical applications such as target tracking, drawing, and scanning control because of their high speed and accuracy. ...

Study of Siphon Breaker Experiment and Simulation for a Research Reactor

Studio di simulazione e sifone Breaker esperimento per un reattore di ricerca

Under the design conditions of a research reactor, the siphon phenomenon induced by pipe rupture can cause continuous outward flow of water. To prevent ...

A Silicon-tipped Fiber-optic Sensing Platform with High Resolution and Fast Response

Una piattaforma con punta di silicio di rilevamento in fibra ottica ad alta risoluzione e risposta veloce

In this article, we introduce an innovative and practically promising fiber-optic sensing platform (FOSP) that we proposed and demonstrated recently. This ...

Production of a Strain-Measuring Device with an Improved 3D Printer

Produzione di un dispositivo di misurazione della deformazione con una stampante 3D migliorata

A traditional strain measurement sensor needs to be electrified and is susceptible to electromagnetic interference. In order to solve the fluctuations in ...

Pneumatically Driven Microfluidic Platform for Micro-Particle Concentration

Piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle

The present article introduces a method for fabricating and operating a pneumatic valve to control particle concentration using a microfluidic platform. ...