Name: computer numerical control micromilling of a microfluidic acrylic device with a staggered restriction for magnetic nanoparticle-based immunoassays
Uploaded: 2022-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays at JoVE.com

この研究は、メキシコのConacytが「Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológics y de Innovación」の助成金312231の下で、AMEXCIDとメキシコ外交省(SRE)によって「Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2」の助成金の下で支援されました。JAHOは、コナシットメキシコの博士課程奨学金に感謝します。

1.マイクロミリング
<ol><li>平面研削<ol><li>マイクロフライス盤と圧電コントローラーの電源を入れます。それぞれの制御ソフトウェア12を起動する。</li>
		<li>必要なエンドミルビット(直径200 μmおよび800 μm)を選択します。フライス盤の適切なコンパートメントに配置します(図1)。</li>
		<li>厚さ1.3 mmのPMMAの9 mm x 25 mmの長方形を800 μmのエンド...

<ol>
	<li>Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoassays+in+microfluidic+systems.">Immunoassays in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).</li><li>Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microfluidic+technology+for+bioanalysis+and+diagnostics.">Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).</li><li>Teste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip+integrating+magnetic+nanoparticles+for+allergy+diagnosis.">Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis.</a> Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., S&#225;nchez-Dom&#237;nguez, M., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-nanoparticles+magnetic+trap:+Toward+high+sensitivity+and+rapid+microfluidic+continuous+flow+enzyme+immunoassay.">Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay.</a> Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).</li><li>Khizar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles+in+microfluidic+and+sensing:+From+transport+to+detection.">Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection.</a> Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).</li><li>Podaru, G., Chikan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAPTER+1:+Magnetism+in+nanomaterials:+Heat+and+force+from+colloidal+magnetic+particles.">CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles.</a> Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , 1-24 (2017).</li><li>Reynoso-Hern&#225;ndez, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+efficiency+of+magnetic+nanoparticles+through+the+compaction+effect+of+a+microparticles+column.">Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column.</a> Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).</li><li>Gale, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+methods+in+microfluidic+device+fabrication+and+future+commercialization+prospects.">A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects.</a> Inventions. 3 (3), 60 (2018).</li><li>Liu, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+microfluidic+devices+and+their+applications+in+protein+and+DNA+analysis.">Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis.</a> Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).</li><li>Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromilling:+A+method+for+ultra-rapid+prototyping+of+plastic+microfluidic+devices.">Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., Jim&#233;nez-Vald&#233;s, R. J., Garc&#237;a-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-actuated+monolithic+acrylic+microfluidic+valves+and+pumps.">Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps.</a> Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).</li><li>Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+affordable+3D-printed+positioner+fixture+improves+the+resolution+of+conventional+milling+for+easy+prototyping+of+acrylic+microfluidic+devices.">An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).</li><li>Friedrich, C. R., Vasile, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+micromilling+process+for+high-aspect-ratio+microstructures.">Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).</li><li>Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+different+materials+response+in+micro+milling+using+four+edged+micro+end+mill+tools.">Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools.</a> Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+low-cost+microfabrication+approach+for+polymethylmethacrylate,+polystyrene,+polycarbonate+and+polysulfone+based+microdevices.">A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices.</a> RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).</li><li>Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-pressure,+high-temperature+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices+and+their+applications+for+electrophoretic+separation.">Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).</li><li>Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+bonding+of+PMMA+and+COC+microfluidic+substrates+using+UV/ozone+surface+treatment.">Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).</li><li>Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+simple+and+fast+thermally-solvent+assisted+method+to+bond+PMMA-PMMA+in+micro-fluidics+devices.">A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).</li><li>Ogilvie, I. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+surface+roughness+for+optical+quality+microfluidic+devices+in+PMMA+and+COC.">Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).</li></ol>

ナノ粒子を免疫担体として用いた免疫測定用のアクリルマイクロ流体デバイスをマイクロミリング技術を用いて作製した。基板上で直接製造する方法は、マスターモールドの使用およびこれが意味する時間とコストを回避するという利点を有する。ただし、ラピッドプロトタイピングと大量生産に限定されます。
ここでは、既報の補機用圧電台用フライス盤<sup class="xref"...

近年、マイクロフルイディクスはイムノアッセイ技術において重要な役割を果たしています1。小型化技術には、サンプルと試薬の消費量の削減、インキュベーション時間の短縮、効率的な溶液交換、高度な統合と自動化など、従来のイムノアッセイと比較して多くの優れた利点があります2。
さらに、イムノアッセイにおけるマイクロ流体システムは、免疫支持体としての磁性ナノ粒子と会合して、インキュベーション時間を大幅に短縮し、表面対体積比の増加により高い検出感度を達成します3。粒子のブラウン運動は、抗原抗体複合体4,5の形成中の反応速度を改善する。さらに、ナノ粒子の磁気特性は、さまざまなマイクロ流体デバイス構成に統合する汎用性を提供し、小型化されたオンチップバイオセンシングシステムにおけるシグナル伝達および分子捕捉の理想的な候補となります5。しかし、磁力は表面対体積比が高いため、ナノメートルスケールの抗力よりも大幅に弱くなります6。したがって、洗浄や検出などの重要なイムノアッセイステップのためにナノ粒子を捕捉することは困難な場合があり、従来の磁石では不十分です4。
ナノ粒子を操作する効率的な方法は、マイクロ流体構造体3に充填された鉄微粒子によって形成されたマイクロ流体磁気トラップの使用である。したがって、外部の磁石が近づくと、磁化された多孔質媒体内で磁力と磁束力の間に複雑な相互作用が生じます。ナノ粒子に作用する磁力は、ナノ粒子を捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分強い3,4,7。このアプローチでは、微粒子を保持するマイクロメトリック構造を生成するために、数マイクロメートルオーダーの分解能を達成する微細加工技術が必要です。
現在の微細加工技術により、数ミクロンから数百ナノメートルの構造の高解像度製造が可能になります8。ただし、これらの技術の多くは、特殊な、高価な、または複雑な機器を必要とします。主な困難の1つは、金型製造のためのクリーンルームの要件であり、これは依然としてコストと時間のかかる8,9です。最近、マイクロ流体エンジニアは、コストの削減、ターンアラウンドタイムの短縮、材料とツールの安価化、機能性の向上など、さまざまな利点を備えたさまざまな代替製造方法を開発することで、この欠点を克服しています8。このように、新しい微細加工技術の開発により、10μm8という低い分解能を達成する低コストの非クリーンルーム法がもたらされました。パターニングは、高価な成形パターンを生成することなく基板上に直接使用できるため、時間のかかるプロセスを回避できます。直接製造方法には、CNCフライス盤、レーザーアブレーション、および直接リソグラフィーが含まれます8。これらの方法はすべて、硬度9に関係なく、幅広い材料で高アスペクト比チャネルを製造するのに適しており、マイクロ流体デバイス8で新しく有利な形状、物理的挙動、および品質を可能にします。
CNCマイクロミリングは、基板からバルク材料を除去する切削工具を使用してマイクロスケール構造を作成し、マイクロ流体デバイス10,11の効果的な製造方法です。マイクロミリング技術は、マイクロ流体アプリケーションでマイクロチャネルと機能を作業面に直接作成するのに役立ち、ワークピースを短時間で(30分未満)製造でき、設計からプロトタイプまでのターンアラウンドタイムを大幅に短縮できるという主な利点を提供します12。さらに、さまざまな材料、サイズ、および形状の切断アクセサリが広く利用できるため、CNCフライス盤は、多くの種類の低コストの使い捨て材料でさまざまな機能の製造を可能にする適切なツールになります13。
マイクロミリングで一般的に使用されるすべての材料の中で、熱可塑性プラスチックは、その多くの好ましい特性と生物学的用途との互換性のために、依然として主要な選択肢です10,14。熱可塑性プラスチックは、低コストの使い捨て分析システムを開発するための大きな利点があるため、マイクロ流体システムにとって魅力的な基板です9。また、大量生産プロセスへの適応性が高く、製品化や量産に適しています。これらの理由から、PMMAなどの熱可塑性プラスチックは、マイクロフルイディクスの初期から信頼性が高く堅牢な材料と見なされてきました10。熱可塑性プラスチックの閉チャネルを製造するためのさまざまなプロトコル、例えば、溶剤接合15、熱接合16、および紫外線(UV)/オゾン表面処理接合17が記載されている。
多くの場合、従来のマイクロミリングマシンで達成される位置決め分解能は、10μm未満の構造を必要とする一部のマイクロ流体アプリケーションでは十分ではありません。ハイエンドのマイクロミリングには十分な解像度があります。残念ながら、価格が高いため、その使用は少数のユーザーに限定されています12。以前、私たちの研究グループは、従来のフライス盤の解像度を克服して、10μm未満の構造を加工できる低コストの工具の製造と操作を報告しました12。フィクスチャは、3つの圧電アクチュエータを含む、シンプルな電子機器で3D印刷によって製造されたプラットフォームです。表面にはヒンジ状のジョイントが含まれており、圧電素子が同時に作用するときに持ち上げることができます。Z軸変位は、500nmの分解能と±1.5μmの精度で制御できます12。
この論文では、マイクロミリング技術によるアクリルデバイス(PMMA)の製造プロセスのステップを紹介します。チップ設計は、幅200μm、高さ200μmのメインチャネルと、試薬の流れをパージするための同じ寸法のサイドチャネルで構成されています。中央領域では、このグループ12によって製造された3Dプリントされた圧電プラットフォームで製造された高さわずか5μmの物理的制限によってチャネルが中断され、外部磁石を配置することによってナノ粒子の磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉する。100 nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを用いて市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによるマイクロ流体デバイスの動作を示す。このデバイスは、それをユニークにするさまざまな機能を兼ね備えています4:免疫サポートとして磁性ナノ粒子を使用すると、合計テスト時間が数時間から数分に短縮されます。検出に蛍光発生酵素を使用すると、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に匹敵する検出限界が可能になります。また、熱可塑性プラスチックを製造材料として使用することで、従来のマイクロ流体ナノ粒子の磁気トラップ3にはなかった大量生産に対応でき、POCTの開発に最適な候補となります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.008 Endmill</td>
			<td>KYOCERA SGS&#160;</td>
			<td>2204</td>
			<td>2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.032 Endmill</td>
			<td>KYOCERA SGS&#160;</td>
			<td>2228</td>
			<td>2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl-iron microparticles&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td>7 &#956;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fermont</td>
			<td>6201</td>
			<td>Health Hazard: Moderate 
			Flammability: None 
			Reactivity: None 
			Contact Hazard: Moderate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Moment</td>
			<td>Teledyne Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Sensor Technology: CMOS 
			Quantum Efficiency: 73% 
			Pixel Size: 4.5 &#181;m x 4.5 &#181;m 
			Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Engrave Software</td>
			<td>Roland DGA Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Engraving software to design and create the engraving path on the surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction hood</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Plastic Tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>ID = 0.020, OD = 0.060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microsope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Dispense Needle</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>98612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade piezoelectric controller application</td>
			<td>LabView&#160;</td>
			<td></td>
			<td>See reference 12 for more details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 495 instant adhesive</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>49503</td>
			<td>Apply with micropipette tip or dispensing needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack</td>
			<td>thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td>12 x 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanic press</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling Machine</td>
			<td>Roland</td>
			<td>MDX-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric platform&#160;</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>See reference 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>ME303018/1</td>
			<td>Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVCamTest software</td>
			<td>Teledyne Photometrics</td>
			<td>Version 3.10.107&#160;</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 7457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMag Carboxyl Beads</td>
			<td>Ocean NanoTech</td>
			<td>KSC0100</td>
			<td>100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>&#160;KDS200</td>
			<td>Can hold up to two syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrasonic bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPanel software&#160;</td>
			<td>Windows OS</td>
			<td>Version 1.0.3.0</td>
			<td>Software for controlling the micromilling machine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computer numerical control micromilling of a microfluidic acrylic device with a staggered restriction for magnetic nanoparticle-based immunoassays

マイクロ流体システムは、イムノアッセイ技術を大幅に改善しました。しかし、多くの微細加工技術は、特殊な、高価、または複雑な装置を必要とするため、製造コストがかかり、大量生産と互換性がなく、ポイントオブケアテスト(POCT)を低リソース環境で採用するための最も重要な前提条件の1つです。この研究では、コンピューター数値制御(CNC)マイクロミリング技術を使用したナノ粒子結合酵素イムノアッセイ試験用のアクリル(ポリメチルメタクリレート、PMMA)デバイスの製造プロセスについて説明します。マイクロ流体デバイスの機能は、100nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを使用して市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによって示されます。このデバイスは、高さわずか5μmの物理的な千鳥制限を統合し、外部磁石を配置することによって磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉するために使用されます。このようにして、コンジュゲートナノ粒子の免疫支持体にかかる磁力は、それらを捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分である。このマイクロ流体デバイスは、イムノアッセイ性能の精度を損なうことなく、低コストの大量生産に特に適しています。

従来のマイクロミリング技術の分解能を向上させる再現性の高い製造プロトコルを確立することができました。このプロトコルを使用して、高さ200 μmのチャネルで互い違いの制限として機能する高さ5 μmの小さなチャネルの作成が達成されます。千鳥状制限のシンプルな設計により、直径7.5μmの鉄微粒子を捕捉し、マイクロチャネルで圧縮すると、外部磁石がデバイスに近づいたときに磁気?...

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Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

マイクロフルイディクスは、診断テストを開発するための強力なツールです。ただし、高価な機器と材料、および面倒な製造と取り扱い技術がしばしば必要とされます。ここでは、低コストで使いやすい設定での磁気マイクロおよびナノ粒子ベースのイムノアッセイ用のアクリルマイクロ流体デバイスの製造プロトコルについて詳しく説明します。

磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

私たちのプロトコルは、ゴールドスタンダードのELISA技術に匹敵する分析物濃度の定量的免疫検出のためのアクリルマイクロ流体デバイスを製造するための高分解能マイクロミリング法について説明しています。ハイライトは、クリーンルームなしでシンプルで低コストの熱可塑性マイクロ流体デバイスを製造することで、アッセイ時間の短縮と定量的な方法での良好な検出限界を可能にします。平面研削から始めます。厚さ1.3ミリメートルのPMMAの9 x 25ミリメートルの長方形を800マイクロメートルのエンドミルビットでカットします。これらの長方形の1つを両面粘着テープで圧電プラットフォームに慎重に取り付けます。Zセンサーを接続して、PMMA長方形の表面に配置します。検出ピンを選択し、センサー表面上に移動します。センサーに接触せずに手動でピンを下げます。Zゼロセンシングモードをアクティブにします。200マイクロメートルのエンドミルビットを14, 500rpmで回転させます。z軸の原点座標までゆっくりと下げます。次に、原点の30マイクロメートル下のz軸をリセットします。この座標を新しい Z 原点として設定します。マイクロフライス盤ソフトウェアのカットボタンをクリックして、カットパネルをアクティブにします。[追加]ボタンをクリックして、アクリル表面の研削用に以前に作成したコードを含むTXTファイルを選択します。[出力]ボタンをクリックしてプロセスを開始します。5マイクロメートル制限のフライス加工では、まずエンドミルビットの回転速度を11, 000rpmに設定します。次に、圧電プラットフォームのインターフェースでプラットフォームを6.5マイクロメートル上げます。エンドミルビットをY軸に沿って500マイクロメートル移動します。圧電プラットフォームを制御インターフェースを使用してz軸の初期値に戻します。次に、設計ソフトウェアから以前に作成した設計ファイルを開いて、マイクロチャネルのミリングを実行します。[印刷]ボタンをクリックし、プロパティメニューにアクセスして、機械加工するデザインを含むレイヤーに対応するカラーウィンドウをクリックします。工具パネルで製造用部品パラメータを設定します。穴のフライス加工には、800マイクロメートルのエンドミルビットに切り替えます。直径1.2ミリメートルの穴の設計レイヤーをアクティブにするには、対応するカラーウィンドウをクリックし、対応する製造パラメータを選択します。長方形の反対側の角に2つの追加の穴を開けて、新しいプラットフォームでアクリルを反転して位置合わせします。アクリルを裏返し、機械加工されたピラーを備えたアダプターの上に両面粘着テープでテープで留めます。設計ソフトウェアから反対側の面の穴の設計を含むファイルを開きます。試薬の入口と出口の穴の残りの半分を直径1.5ミリメートル、深さ0.7ミリメートルで粉砕します。両方のアクリル長方形シートをイソプロピルアルコールできれいにし、蒸留水ですすいでください。アクリルを超音波浴に10分間浸します。両方のアクリルシートを乾燥させ、両面テープでガラスのペトリ皿の蓋の内側にテープで留めます。次に、ガラスのペトリ皿のベースを大きなガラスのペトリ皿の中に置きます。1ミリリットルのクロロホルムをペトリ皿の底に注ぎ、アクリルシートで蓋を素早く置きます。すぐに蒸留水を大きなペトリ皿の底にペトリ皿の蓋の高さまで加えます。アクリルをクロロホルムガスに1分間さらします。次に、ペトリ皿を傾けてウォーターシールを破り、すぐにペトリ皿の覆いを外します。接着するには、両方のアクリルとクロロホルムの露出面を向かい合わせ、サンドイッチを形成します。アクリルを2分間隔で2回プレスに入れ、アクリルの位置合わせを変えます。次に、瞬間乾燥液体接着剤を使用して、デバイスの各穴に2〜3センチメートルのホースを取り付けます。注射器を使用してチャネルを蒸留水で満たします。デバイスを超音波浴に10分間浸します。次に、デバイスチャネル内の水を空にし、シリンジを使用して5%BSA溶液を導入します。5%BSA中で7.5マイクロメートルの直径の鉄微粒子の懸濁液を調製する。チップと微粒子懸濁液をブロッキング溶液とともに室温で少なくとも1時間インキュベートします。次に、サイドチャネル出口ホースを通してシリンジ針で微粒子をチップに挿入します。チップを垂直に置き、90度の2段階でチップを回転させ、微粒子が5マイクロメートルの制限でターゲットにしてコンパクトになるようにします。アクリル装置のすべてのホースを熱で密封します。数ミリメートルしか残らなくなるまでインレットホースを切ります。ディスペンシングニードルに洗浄バッファーを満たし、カットホースに挿入します。溶液を滴下させてから、針をデバイスに接続します。出口ホースを横方向のチャネルから切断し、シリンジポンプに接続します。次に、メインチャンネルアウトレットホースについても同じ手順を繰り返します。次に、チップを磁石に取り付けます。免疫検出のために、洗浄バッファーを毎時50マイクロリットルで10分間流し続けます。マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除き、50マイクロリットルのナノ粒子懸濁液を追加します。ナノ粒子懸濁液を毎時100マイクロリットルの流速で7分間流す。次に、流量を毎時50マイクロリットルに変更し、さらに15分間流量を続けます。分注針を交換し、洗浄バッファーを同じ速度で10分間流します。マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除き、100マイクロリットルの蛍光発生基質を追加します。基質投入、蛍光測定、洗浄ステップの流量と時間パラメータを調整します。蛍光発生基質の投入フローを毎時50マイクロリットルで6分間活性化します。基板の流れが止まる15秒前に、顕微鏡の蛍光をオンにします。基板が1, 000ミリ秒の露光時間で停止する10秒前に顕微鏡カメラのソフトウェアで画像キャプチャを開始します。基板洗浄が停止した直後に、目的の流量パラメータの[開始]ボタンをクリックします。毎秒1フレームで6分間のイメージングを実行します。選択した測定フローが停止した直後に、洗浄フローの開始ボタンをクリックします。リゾチーム結合ナノ粒子および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体をイムノアッセイに使用した。トラップ前後の領域を比較すると、異なる濃度の一次抗体の蛍光強度の増加が観察され、基質蛍光の変化が一次抗体の濃度に正比例することを示しています。所与の濃度の一次抗体について、蛍光強度を、蛍光発生基質の異なる流速における時間の関数としてプロットした。HRP酵素による基質の変換容量は流速に反比例し、1時間あたり1マイクロリットルの流速に対して最大強度が得られた。様々な一次抗体濃度の異なる流速について、免疫反応前後の蛍光差の曲線は、1ミリリットル当たり1, 000ナノグラムの濃度に対して、評価された全ての流速について蛍光が飽和することを示した。各流速の一次抗体の濃度に対して得られた蛍光強度の差の最大値を用いて検量線を作成した。1時間あたり1マイクロリットルでの高い変動性と高い蛍光レベルは、速度が反応基質の流れに有利ではなく、トラップの直後に蓄積する傾向があることを示唆しました。クロロホルムへの暴露は温度に非常に敏感であるため、マイクロチャネルのシーリングステップには特別な注意を払う必要があります。再現性のある結果を得るには、温度が常に同じである必要があります。当社のシステムは、ナノ粒子ベースのマイクロ流体イムノアッセイにおける検出限界の決定要因である、微粒子のコンパクトさとサイズ、ナノ粒子サイズ、抗原、検出抗体および基質のどこにあるかを理解するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Engineering

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