Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

أجريت جميع التجارب باستخدام الحيوانات في كلية ولاية بنسلفانيا للطب، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ولاية بنسلفانيا، وأجريت وفقا للمعايير الأخلاقية المنصوص عليها في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم استخدام إناث C57BL / 6 الفئران البالغة من العمر 12...

<ol>
	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

في الجسم الحي ، يعد نقل الجينات في العضلات الهيكلية المعززة بالكهرباء أداة مفيدة وبسيطة نسبيا لتعديل تعبير البروتين في العضلات. لقد أظهرنا الخطوات المطلوبة لتحقيق نقل فعال للجينات في عضلات EDL و TA وأثبتنا أن قياس الانقباض في EDL قابل للتطبيق بعد الإجراء. لا تتطلب هذه التقنية ناقلات فيرو...

يعد كهربية الحمض النووي البلازميدي في العضلات الهيكلية في الجسم الحي أداة مهمة لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات الهيكلية والإشارات الجزيئية عن طريق تعديل التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تم إثبات نقل الجينات التجريبية إلى العضلات الهيكلية في وقت مبكر من عام 1990 من قبل وولف وآخرون ، حيث تم نقل كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي بنجاح دون كهربية ، وتم الحفاظ على تعبير luciferase لمدة شهرين على الأقل10. إن كفاءة النقل المنخفضة نسبيا مع الحقن فقط تمثل مشكلة ، وقد أظهر أيهارا وميازاكي زيادة في نقل الجينات باستخدام الكهربية في عام 1998 عن طريق كهربية بناء pCAGGS-IL-5 في عضلة الظنبوب الأمامية (TA) وقياس تعبير المصل IL-511. منذ ذلك الوقت ، حققت العديد من الدراسات في فعالية تركيزات الحمض النووي المختلفة ، والأحجام ، ومعلمات الكهربية لضمان أقصى قدر من كفاءة نقل الجينات. اختبر مير وآخرون معلمات كهربائية مختلفة ، بما في ذلك الجهد ، وعدد النبض ، ومدة النبض ، والتردد ، بالإضافة إلى تركيز الحمض النووي ، وقرروا أن زيادة الجهد ، وعدد النبضات ، وتركيز الحمض النووي كلها ساهمت في زيادة كفاءة الكهربية12. أحد التحذيرات الرئيسية من الجهد الكهربائي العالي هو أنه في حين أنه يسهل زيادة امتصاص الحمض النووي في الألياف العضلية ، فإنه يسبب أيضا تلفا في العضلات ، مما قد يؤدي إلى إرباك النتائج. أظهر Schertzer et al. أن الكهربية عند 200 فولت تسببت في تلف حوالي 50٪ من الألياف العضلية بعد 3 أيام من المسام الكهربائية ، في حين أن 10٪ فقط من الألياف العضلية تضررت عند 50 فولت13. لقد أخذنا في الاعتبار المتغيرات التي تؤثر على نقل الحمض النووي بكفاءة مقابل تلف العضلات ووجدنا أن الجهد البالغ 125 فولت في المائة من عرض الفرجار يكفي لتحقيق نقل فعال للجينات.
يعد تحليل منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات وانقباض العضلات بالكامل بعد الكهربية من الجوانب المهمة لطريقة قياس التغيرات في حجم العضلات ووظيفتها بسبب تعديل الجينات. لقد أثبتنا نحن وآخرون سابقا أن كهربية ناقلات المكافحة وحدها لا تسبب انخفاضا في منطقة الألياف العضلية. كان بناء بروتين الفلورسنت الأخضر (EGFP) مؤشرا فلوريا مفيدا لنقل الحمض النووي في هذه الدراسات13,14. قام عدد من الدراسات بالتحقيق في انقباض TA في الموقع بعد الكهربية ووجدوا نتائج متفاوتة. أظهرت إحدى الدراسات أن الكهربية 75 فولت / سم تسببت في انخفاض بنسبة 30٪ في قوة الكزاز بعد 3 أيام من الكهربية ، وبحلول 7 أيام بعد الكهربية ، عادت قوة الكزاز إلى مستوى التحكم ، في حين أن 50 فولت / سم من الكهربية لم تؤثر على القوة13,15. أظهرت دراسة أخرى أن هناك فقدانا بنسبة 30٪ لقوة الكزاز 3 ساعات بعد 180 فولت / سم من الكهرباء ، والتي تعافت إلى مستويات القوة الزائفة بعد 7 أيام16.
في الإجراء التفصيلي التالي ، نوضح الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) للفئران. كما نثبت أن هذه الطريقة لا تؤثر على انقباض العضلات بالكامل لدى EDL. والهدف من ذلك هو إظهار كفاءة امتصاص البلازميد في الألياف العضلية دون التسبب في فقدان الوظيفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

يعد تعديل التعبير الجيني العابر في العضلات الهيكلية الفئرانية بواسطة بالكهرباء البلازميدية أداة مفيدة لتقييم الفسيولوجيا الطبيعية والمرضية. إن الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة أو إسقاطها يمكن الباحثين من التعامل مع الأحداث الجزيئية الفردية ، وبالتالي فهم أفضل للآليات التي تؤثر على كتلة العضلات ، واستقلاب العضلات ، والانقباض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إلكتروبورات بلازميدات الحمض النووي التي تشفر علامات الفلورسنت تسمح للباحثين بقياس التغيرات في التوطين تحت الخلوي للبروتينات في العضلات الهيكلية في الجسم الحي. يتضمن التقييم الوظيفي الرئيسي للعضلات الهيكلية قياس انقباض العضلات. في هذا البروتوكول ، نثبت أن دراسات انقباض العضلات الكاملة لا تزال ممكنة بعد حقن الحمض النووي البلازميد ، والكهربية ، وتعديل التعبير الجيني. الهدف من هذا الإجراء التعليمي هو إظهار الطريقة خطوة بخطوة للبلازميد الكهربائي للحمض النووي في العضلات الهيكلية للفأر لتسهيل الامتصاص والتعبير في الألياف العضلية للعضلات الطويلة الأمامية والباسطة الرقمية ، وكذلك لإثبات أن انقباض العضلات الهيكلية لا يتعرض للخطر عن طريق الحقن والكهرب.

الكهربية لتسهيل نقل الجينات في العضلات الهيكلية هي تقنية مفيدة تستخدم لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات. لقد أظهرنا إجراء مفصلا خطوة بخطوة لتحقيق نقل الجينات بكفاءة في كل من عضلات TA و EDL. تحدث الاختلافات في كفاءة النقل بسبب عدد من المتغيرات. من بين هذه المتغيرات معلمات الكهربية (النبضا?...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.

كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

يعد نقل الجينات بوساطة الكهربية في العضلات تقنية سهلة وفعالة للتحقيق في التغيرات في فسيولوجيا العضلات. وجدنا أن الكهربية لا تضر بانقباض العضلات. إن التركيب الكهربائي للجينات في العضلات في الجسم الحي هو إجراء بسيط وفعال لا يتطلب تعبئة أكثر شمولا للبنى الجينية في ناقلات فيروسية.من الصعب تصور مؤسسة كهرباء لبنان وعزلها وحقنها بسبب موقعها وصغر حجمها. قد تساعد الممارسة على جثة الفأر وحقن الحبر البيولوجي مثل حبر الهند في تقديم دليل على الحقن الكافي. سيوضح الإجراء براين هاين ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري.قبل حقن الفأر ، تأكد من المستوى الجراحي للتخدير باستخدام ملقط مع عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، ثم انقل الماوس إلى مخروط الأنف الذي يستريح على صفيحة ماء متداولة عند 37 درجة مئوية لبقية الإجراء. بمجرد وضع الماوس في وضع ضعيف ، قم بإزالة الشعر من كلا الطرفين الخلفيين باستخدام ماكينات قص الشعر الصغيرة ، ثم قم بتعقيم منطقة الحقن بالتناوب بنسبة 70٪ من الإيثانول والبيتادين. بالنسبة للحقن ، حدد موقع الظنبوب الأمامي أو وتر TA المرئي من خلال الجلد على الجانب الجانبي من أسفل الساق وحدد الطرف العلوي من عضلة TA.ثم أدخل إبرة قياس 30 مثبتة على حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر في العضلات بزاوية خمس درجات ضحلة من واحد إلى مليمترين أعلى من الوصلة العضلية حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي من العضلات. قم بخفض المكبس أثناء سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لتوصيل 50 ميكرولتر من محلول البلازميد إلى العضلات. يجب أن تنتفخ العضلات.اضبط المؤقت لمدة دقيقة واحدة وقم بقياس سمك الساق في عضلة TA ، ثم اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة. ثم اضبط الجهد الكهربائي على 12.5 فولت لكل ملليمتر. بعد دقيقة واحدة ، ضع أقطاب الفرجار الكهربائية عن كثب حول الطرف السفلي دون أن تكون مشدودة بشكل مفرط لتقديم خمس نبضات موجة مربعة لمدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية.يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة. كرر الإجراء مع الطرف الآخر باستخدام ناقل بلازميد التحكم. عند الانتهاء، قم بإزالة الماوس من مخروط الأنف واسمح للماوس بالتعافي على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية.بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع قمة عظم الساق الأمامية بصريا ومن خلال خفقان لطيف. استخدم مشرطا لإجراء شق ضحل عبر الجلد على الجانب الجانبي من قمة الساق الأمامية التي تقل بمقدار خمسة ملليمترات عن الركبة إلى مليمترين أعلى من الوصلة العضلية TA.بمساعدة مقص صغير ، قم بتشريح اللفافة بصراحة ، وكشف عضلة TA ، ثم فصل عضلة TA عن الساق بلطف عن طريق سحب العضلة للكشف عن الباسطة الرقمية الطويلة أو EDL. حافظ على TA واضحا من EDL أثناء الإجراء باستخدام ملقط منحني صغير. أدخل الإبرة ذات المقياس 30 في EDL طوليا حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي للعضلة وحقن 10 ميكرولترات من محلول البلازميد كما هو موضح من قبل.يجب أن تنتفخ عضلة EDL. قم بقياس سمك الساق في EDL واضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة لتقديم خمس نبضات موجة مربعة كما هو موضح سابقا. عند الانتهاء من ذلك ، أغلق الشق باستخدام خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص يمكن التخلص منها 4-0.قم لاحقا بإزالة الماوس من مخروط الأنف واسمح له بالتعافي على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. إعطاء مسكن مناسب تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة وبعد 12 إلى 24 ساعة من الجراحة. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى القفص المنزلي.بعد الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA و EDL ، لوحظ تعبير GFP يشير إلى امتصاص الحمض النووي في ألياف العضلات. عند تصويرها بتكبير أقل ، يمكن تصور كفاءة نقل العضلات EDL من خلال ظهور الألياف الخضراء مقابل الألياف السوداء. كان ل EDLs المحقونة والكهربائية استجابات تيتانيك مماثلة عند 100 هرتز مقارنة بالعضلات غير المحقونة أو الكهربية الضابطة.لم يتم المساس ب EDL المحقون والكهربائي ، وقوة العضلات الكزازية ، وقوة العضلات الكزازية المحددة ، والوقت اللازم لذروة التوتر ، ونصف وقت الاسترخاء مقارنة بالتحكم الذي لم يمسه أحد. من المهم تحديد العضلات المراد حقنها بدقة وتقديم محلول البلازميد بكفاءة. يمكن إجراء عدد من القياسات النسيجية والكيميائية الحيوية باستخدام هذا البروتوكول.يمكن إجراء توطين الخلايا المستهدفة للبروتين ، وضربة قاضية للجين المستهدف ، ومراسلي النسخ ، ومجموعة من تلطيخ الأنسجة. تم استخدام هذه التقنية لتحديد مجموعة واسعة من التغييرات في الإشارات الجزيئية في العضلات خلال الظروف الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. التحقيق في انقباض العضلات بعد نقل الجينات ممكن باستخدام هذه التقنية.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

ترنسفكأيشن الحمض النووي لعضلات الهيكل العظمي باستخدام الثدييات في فيفو Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

تبسيط تنقية DNA البلازميد من ثقافات بروكاريوتيك

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...