Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Alle forsøg med dyr blev udført på Penn State College of Medicine, godkendt af Penn State University's Institutional Animal Care and Use Committee og udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer. 12 uger gamle C57BL/6-hunmus blev anvendt til denne procedure. Alle kirurgiske værktøjer blev autoklaveret for sterilitet inden eksperimentering.
1. Forberedelse af injektion/elektroporation af TA og EDL</stro...

<ol>
	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

In vivo-genoverførsel i skeletmuskulatur forstærket ved elektroporation er et nyttigt og relativt simpelt værktøj til modulering af proteinekspression i muskler. Vi har vist de trin, der kræves for at opnå effektiv genoverførsel i EDL- og TA-musklerne og demonstreret, at kontraktilitetsmåling af EDL er levedygtig efter proceduren. Denne teknik kræver ikke mere komplicerede virale vektorer og giver mulighed for sammenligning af transinficeret og ikke-transficeret muskelfiber tværsnitsareal i en enkelt m...

Plasmid DNA-elektroporation i skeletmuskulatur in vivo er et vigtigt redskab til vurdering af ændringer i skeletmuskelfysiologi og molekylær signalering ved at modulere genekspression i en række fysiologiske og patofysiologiske tilstande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentel genoverførsel til skeletmuskulatur blev demonstreret allerede i 1990 af Wolff et al., hvor både RNA og DNA med succes blev overført uden elektroporation, og luciferaseekspression blev opretholdt i mindst 2 måneder10. Den relativt lave transfektionseffektivitet kun med injektion er problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerede øget genoverførsel med elektroporation i 1998 ved at elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis forreste (TA) muskel og måle serum IL-5-ekspression11. Siden da har mange undersøgelser undersøgt effekten af forskellige DNA-koncentrationer, volumener og elektroporationsparametre for at sikre maksimal genoverførselseffektivitet. Mir et al. testede forskellige elektroporationsparametre, herunder spænding, pulstal, pulsvarighed og frekvens samt DNA-koncentration og fastslog, at større spænding, pulstal og DNA-koncentration alle bidrog til øget elektroporationseffektivitet12. En stor advarsel mod høj elektroporationsspænding er, at mens det letter øget DNA-optagelse i myofibre, forårsager det også muskelskader, hvilket kan forvirre resultaterne. Schertzer et al. viste, at elektroporation ved 200 V forårsagede skade i omkring 50% af myofibrene 3 dage efter elektroporation, mens kun 10% af myofibrene blev beskadiget ved 50 V13. Vi har taget højde for de variabler, der påvirker effektiv DNA-overførsel versus muskelskade og fundet ud af, at en spænding på 125 V pr. Centimeter kaliberbredde er tilstrækkelig til at opnå effektiv genoverførsel.
Analyse af muskelfibertværsnitsareal og hel muskelkontraktilitet efter elektroporation er vigtige aspekter af metoden til måling af ændringer i muskelstørrelse og funktion på grund af genmodulation. Vi og andre har tidligere vist, at elektroporation af kontrolvektorer alene ikke forårsager et fald i myofiberområdet. Konstruktionen af det grønne fluorescerende protein (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator for DNA-transfektion i disse undersøgelser13,14. En række undersøgelser har undersøgt in situ kontraktilitet af TA efter elektroporation og fundet varierende resultater. En undersøgelse viste, at 75 V / cm elektroporation forårsagede ca. 30% reduktion i tetanisk kraft 3 dage efter elektroporation, og ved 7 dage efter elektroporation var tetanisk kraft tilbage til kontrolniveauet, mens 50 V / cm elektroporation ikke kompromitterede kraft13,15. En anden undersøgelse viste, at der var et tab på 30% af tetanisk kraft 3 timer efter 180 V / cm elektroporation, som kom sig til de falske kraftniveauer efter 7 dage16.
I den følgende detaljerede procedure demonstrerer vi injektion og elektroporation af et pcDNA3-EGFP plasmid i TA og extensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også, at denne metode ikke påvirker EDL helmuskelkontraktilitet. Målet er at demonstrere effektiv plasmidoptagelse i myofibre uden at forårsage tab af funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

Transient genekspressionsmodulation i murine skeletmuskulatur ved plasmidelektroporation er et nyttigt værktøj til vurdering af normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown af målgener gør det muligt for efterforskere at manipulere individuelle molekylære begivenheder og dermed bedre forstå de mekanismer, der påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. Derudover giver elektroporation af DNA-plasmider, der koder for fluorescerende tags, efterforskere mulighed for at måle ændringer i subcellulær lokalisering af proteiner i skeletmuskulatur in vivo. En vigtig funktionel vurdering af skeletmuskulatur omfatter måling af muskelkontraktilitet. I denne protokol viser vi, at undersøgelser af hele muskelkontraktilitet stadig er mulige efter plasmid-DNA-injektion, elektroporation og genekspressionsmodulation. Målet med denne instruktionsprocedure er at demonstrere den trinvise metode til DNA-plasmidelektroporation i museskeletmuskulatur for at lette optagelse og ekspression i myofibrene i tibialis forreste og extensor digitorum longus muskler samt at demonstrere, at skeletmuskelkontraktilitet ikke kompromitteres ved injektion og elektroporation.

Elektroporation for at lette genoverførsel i skeletmuskulatur er en nyttig teknik, der bruges til at evaluere ændringer i muskelfysiologi. Vi har demonstreret en detaljeret, trin-for-trin procedure for at opnå effektiv genoverførsel i både TA- og EDL-musklerne. Forskelle i transfektionseffektivitet opstår på grund af en række variabler. Blandt disse variabler er elektroporationsparametre (pulser, spænding, pulsvarighed osv.), Genkonstruktionsstørrelse og koncentration / volumen af injiceret DNA. Vi har tidliger...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Elektroporation af plasmid-DNA i skeletmuskulatur er en levedygtig metode til at modulere genekspression uden at gå på kompromis med muskelkontraktilitet hos mus.

Elektroporation af plasmid-DNA i musens skeletmuskel

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Elektroporationsmedieret genoverførsel i muskler er en nem og effektiv teknik til at undersøge ændringer i muskelfysiologi. Vi fandt ud af, at elektroporation ikke kompromitterer muskelkontraktilitet. Elektroporation af genkonstruktioner i muskel in vivo er en enkel og effektiv procedure, der ikke kræver mere omfattende emballering af genkonstruktioner i virale vektorer.Det er vanskeligt at visualisere, isolere og injicere EDL på grund af dets placering og lille størrelse. Øvelse på en musekroppe og injektion af biologisk blæk såsom indisk blæk kan hjælpe med at give bevis for tilstrækkelig injektion. Demonstration af proceduren vil være Brian Hain, en post doc fra mit laboratorium.Før du injicerer musen, skal du bekræfte det kirurgiske anæstesiplan ved hjælp af pincet med fravær af tåknipperefleksen og derefter overføre musen til en næsekegle, der hviler på en cirkulerende vandplade ved 37 grader Celsius for resten af proceduren. Når musen er placeret i en liggende stilling, skal du fjerne hår fra begge bagben ved hjælp af små hårklippere og derefter desinficere injektionsområdet med skiftevis 70% ethanol og betadin. Til injektionen lokaliseres tibialis forreste eller TA-senen, der er synlig gennem huden på den laterale side af underbenet, og markér den overlegne ende af TA-musklen.Indsæt derefter en 30-gauge nål monteret på en 50-mikroliter mikrosprøjte i musklen i en lav fem graders vinkel en til to millimeter bedre end det myotendinøse kryds, indtil nålen når den overlegne ende af musklen. Tryk stemplet ned, mens du langsomt trækker nålen tilbage langs injektionsstien for at levere 50 mikroliter af plasmidopløsningen ind i musklen. Musklen skal svulme.Indstil timeren i et minut, og mål tykkelsen af benet ved TA-musklen, og indstil derefter tykkelseselektroderne til den målte tykkelse. Indstil derefter elektroporatorspændingen til 12,5 volt pr. Millimeter. Efter et minut skal du placere kaliberelektroderne tæt omkring underekstremiteten uden at være alt for stramme for at levere fem firkantede bølgeimpulser med 20 millisekunders varighed og 200 millisekunders intervaller.Musklen skal rykke med hver puls. Gentag proceduren med den anden lem ved hjælp af kontrolplasmidvektoren. Når du er færdig, skal du fjerne musen fra næsekeglen og lade musen komme sig på en varmepude indstillet til 37 grader Celsius.Når den er genoprettet, skal du returnere musen til buret. Med musen i en liggende stilling skal du lokalisere skinnebensknoglens forreste kam visuelt og gennem blid hjertebanken. Brug en skalpel til at lave et lavt snit gennem huden på den laterale side af skinnebenets forreste kam fem millimeter ringere end knæet til to millimeter bedre end TA myotendinous junction.Ved hjælp af en lille saks dissekeres fasciaen, udsætter TA-musklen, og adskil derefter TA-musklen forsigtigt fra skinnebenet ved at trække musklen for at afsløre extensor digitorum longus eller EDL. Hold TA fri fra EDL under proceduren ved hjælp af små buede pincet. Indsæt 30-gauge nålen i EDL i længderetningen, indtil nålen når den overlegne ende af musklen, og injicer 10 mikroliter af plasmidopløsningen som demonstreret før.EDL-musklen skal svulme op. Mål tykkelsen af benet ved EDL og indstil tykkelseselektroderne til den målte tykkelse for at levere fem firkantede bølgeimpulser som forklaret tidligere. Når du er færdig, skal du lukke snittet ved hjælp af engangs 4-0 ikke-absorberbare nylonsuturer.Fjern senere musen fra næsekeglen og lad den komme sig på en varmepude indstillet til 37 grader Celsius. Administrer et passende subkutant analgetikum umiddelbart efter operationen og 12 til 24 timer efter operationen. Når den er genoprettet, skal musen returneres til hjemmeburet.Efter injektion og elektroporation af pcDNA3-EGFP-plasmidet i TA- og EDL-musklerne blev GFP-ekspressionen observeret, hvilket indikerer DNA-optagelse i muskelfibrene. Når den afbildes ved en lavere forstørrelse, kunne EDL-muskeltransfektionseffektiviteten visualiseres gennem udseendet af grønne fibre versus sorte fibre. De injicerede og elektroporerede EDL'er havde lignende tetaniske reaktioner ved 100 Hertz sammenlignet med de kontrol ikke-injicerede eller elektroporerede muskler.Den injicerede og elektroporerede EDL, den tetaniske muskelkraft, specifik tetanisk muskelkraft, tid til topspænding og halv afslapningstid blev ikke kompromitteret sammenlignet med den uberørte kontrol. Det er vigtigt at identificere den muskel, der skal injiceres, nøjagtigt og effektivt levere plasmidopløsningen. En række histologiske og biokemiske målinger kan foretages ved hjælp af denne protokol.Målproteincellulær lokalisering, målgen knockdown, transkriptionelle journalister og en række vævsfarvning kan udføres. Denne teknik er blevet brugt til at identificere en lang række ændringer i molekylær signalering i muskler under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Undersøgelsen af muskelkontraktiliteten efter genoverførsel er mulig ved hjælp af denne teknik.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detektion og analyse af DNA-skader i Mouse Skeletmuskel<em&gt; In Situ</em&gt; Brug af TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nye metode af Plasmid DNA levering til musen blære Urothelium af elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...