Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd aan het Penn State College of Medicine, goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Penn State University, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Voor deze procedure werden 12 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen gebruikt. Alle chirurgische hulpmiddelen werden geautoclaveerd voor steriliteit voorafgaand aan experimenten.
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

In vivo genoverdracht in skeletspieren versterkt door elektroporatie is een nuttig en relatief eenvoudig hulpmiddel voor het moduleren van eiwitexpressie in spieren. We hebben de stappen getoond die nodig zijn om een efficiënte genoverdracht in de EDL- en TA-spieren te bereiken en hebben aangetoond dat contractiliteitsmeting van de EDL levensvatbaar is na de procedure. Deze techniek vereist geen meer gecompliceerde virale vectoren en maakt de vergelijking mogelijk van getransfecteerde en niet-getransfecteerde s...

Plasmide DNA-elektroporatie in skeletspieren in vivo is een belangrijk hulpmiddel voor het beoordelen van veranderingen in de skeletspierfysiologie en moleculaire signalering door genexpressie te moduleren in een verscheidenheid aan fysiologische en pathofysiologische omstandigheden 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentele genoverdracht in de skeletspieren werd al in 1990 aangetoond door Wolff et al., waarbij zowel RNA als DNA met succes werden overgedragen zonder elektroporatie, en luciferase-expressie gedurende ten minste 2 maanden werd gehandhaafd10. De relatief lage transfectie-efficiëntie met alleen injectie is problematisch, en Aihara en Miyazaki toonden in 1998 een verhoogde genoverdracht met elektroporatie door een pCAGGS-IL-5-construct in de tibialis anterieure (TA) spier te elektropoderen en serum IL-5 expressie11 te meten. Sinds die tijd hebben veel studies de werkzaamheid van verschillende DNA-concentraties, volumes en elektroporatieparameters onderzocht om maximale genoverdrachtsefficiëntie te garanderen. Mir et al. testten verschillende elektroporatieparameters, waaronder spanning, pulsgetal, pulsduur en frequentie, evenals DNA-concentratie, en stelden vast dat een grotere spanning, pulsgetal en DNA-concentratie allemaal bijdroegen aan een verhoogde elektroporatie-efficiëntie12. Een belangrijk voorbehoud bij een hoge elektroporatiespanning is dat, hoewel het een verhoogde DNA-opname in myofiberen vergemakkelijkt, het ook spierschade veroorzaakt, wat de resultaten kan verstoren. Schertzer et al. toonden aan dat elektroporatie bij 200 V schade veroorzaakte in ongeveer 50% van de myofiberen 3 dagen na elektroporatie, terwijl slechts 10% van de myofiberen beschadigd was bij 50 V13. We hebben rekening gehouden met de variabelen die van invloed zijn op efficiënte DNA-overdracht versus spierschade en ontdekten dat een spanning van 125 V per centimeter remklauwbreedte voldoende is om effectieve genoverdracht te bereiken.
Analyse van het dwarsdoorsnedegebied van spiervezels en de contractiliteit van de hele spier na elektroporatie zijn belangrijke aspecten van de methode voor het meten van veranderingen in spiergrootte en -functie als gevolg van genmodulatie. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat elektroporatie van controlevectoren alleen geen afname van het myofibergebied veroorzaakt. Het groene fluorescerende eiwit (EGFP) construct was een nuttige fluorescerende indicator van DNA-transfectie in deze studies13,14. Een aantal studies hebben de in situ contractiliteit van de TA na elektroporatie onderzocht en vonden wisselende resultaten. Eén studie toonde aan dat 75 V /cm elektroporatie ongeveer 30% vermindering van de tetanische kracht veroorzaakte 3 dagen na elektroporatie, en 7 dagen na elektroporatie was de tetanische kracht terug op het controleniveau, terwijl 50 V / cm elektroporatie kracht13,15 niet in gevaar bracht. Een andere studie toonde aan dat er een verlies van 30% van tetanische kracht was 3 uur na 180 V / cm elektroporatie, die na 7 dagen herstelde tot de schijnkrachtniveaus16.
In de volgende gedetailleerde procedure demonstreren we injectie en elektroporatie van een pcDNA3-EGFP plasmide in de TA- en extensor digitorum longus (EDL) spieren van muizen. We tonen ook aan dat deze methode geen invloed heeft op de contractiliteit van de hele spieren van EDL. Het doel is om een efficiënte opname van plasmide in myofiberen aan te tonen zonder functieverlies te veroorzaken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

Voorbijgaande genexpressiemodulatie in muizenskeletspieren door plasmide-elektroporatie is een nuttig hulpmiddel voor het beoordelen van normale en pathologische fysiologie. Overexpressie of knockdown van doelgenen stelt onderzoekers in staat om individuele moleculaire gebeurtenissen te manipuleren en zo de mechanismen die van invloed zijn op spiermassa, spiermetabolisme en contractiliteit beter te begrijpen. Bovendien stelt elektroporatie van DNA-plasmiden die fluorescerende tags coderen onderzoekers in staat om veranderingen in subcellulaire lokalisatie van eiwitten in skeletspieren in vivo te meten. Een belangrijke functionele beoordeling van de skeletspieren omvat de meting van spiercontractiliteit. In dit protocol tonen we aan dat hele spiercontractiliteitsstudies nog steeds mogelijk zijn na plasmide-DNA-injectie, elektroporatie en genexpressiemodulatie. Het doel van deze instructieprocedure is om de stapsgewijze methode van DNA-plasmide-elektroporatie in de skeletspieren van muizen te demonstreren om de opname en expressie in de myofiberen van de tibialis anterieure en extensor digitorum longusspieren te vergemakkelijken, evenals om aan te tonen dat de contractiliteit van de skeletspier niet wordt aangetast door injectie en elektroporatie.

Elektroporatie om genoverdracht in skeletspieren te vergemakkelijken is een nuttige techniek die wordt gebruikt om veranderingen in de spierfysiologie te evalueren. We hebben een gedetailleerde, stapsgewijze procedure gedemonstreerd om efficiënte genoverdracht in zowel de TA- als de EDL-spieren te bereiken. Verschillen in transfectie-efficiëntie treden op als gevolg van een aantal variabelen. Onder deze variabelen zijn elektroporatieparameters (pulsen, spanning, pulsduur, enz.), genconstructgrootte en concentratie / vo...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Elektroporatie-gemedieerde genoverdracht in spieren is een eenvoudige en efficiënte techniek om veranderingen in de spierfysiologie te onderzoeken. We ontdekten dat elektroporatie de spiercontractiliteit niet in gevaar brengt. Elektroporatie van genconstructen in spier in vivo is een eenvoudige en efficiënte procedure die geen uitgebreidere verpakking van genconstructen in virale vectoren vereist.Het is moeilijk om de EDL te visualiseren, te isoleren en te injecteren vanwege de locatie en het kleine formaat. Oefenen op een muizenkarkas en injectie van biologische inkt zoals India-inkt kan helpen bij het leveren van bewijs van voldoende injectie. Brian Hain, een postdoc uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.Voordat u de muis injecteert, bevestigt u het chirurgische anesthesievlak met behulp van een tang met de afwezigheid van de teenknijflex en brengt u de muis vervolgens over naar een neuskegel die rust op een circulerende waterplaat bij 37 graden Celsius voor de rest van de procedure. Zodra de muis in rugligging is geplaatst, verwijdert u het haar van beide achterpoten met behulp van kleine tondeuses en ontsmet u vervolgens het injectiegebied met afwisselend 70% ethanol en betadine. Lokalis voor de injectie de tibialis anterieure of TA-pees zichtbaar door de huid aan de zijkant van het onderbeen en markeer het superieure uiteinde van de TA-spier.Steek vervolgens een naald van 30 gauge gemonteerd op een microspuit van 50 microliter in de spier in een ondiepe hoek van vijf graden van één tot twee millimeter die superieur is aan de myotendineuze overgang totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt. Druk de zuiger in terwijl u de naald langzaam langs het injectiepad intrekt om 50 microliter van de plasmide-oplossing in de spier af te leveren. De spier moet opzwellen.Stel de timer in op één minuut en meet de dikte van het been bij de TA-spier en stel vervolgens de remklauwelektroden in op de gemeten dikte. Stel vervolgens de elektroporatorspanning in op 12,5 volt per millimeter. Plaats na een minuut de remklauwelektroden dicht bij de onderste ledemaat zonder te strak te zijn om vijf blokgolfpulsen te leveren met een duur van 20 milliseconden en intervallen van 200 milliseconden.De spier moet trillen bij elke puls. Herhaal de procedure met de andere ledemaat met behulp van de controleplasmidevector. Als u klaar bent, verwijdert u de muis uit de neuskegel en laat u de muis herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 graden Celsius.Eenmaal hersteld, brengt u de muis terug naar zijn kooi. Met de muis in rugligging, lokaliseer de tibia bot voorste top visueel en door zachte hartkloppingen. Gebruik een scalpel om een ondiepe incisie door de huid te maken aan de laterale kant van de tibia anterieure top vijf millimeter inferieur aan de knie tot twee millimeter superieur aan de TA myotendinous junction.Met behulp van een kleine schaar ontleedt u botweg de fascia, waardoor de TA-spier wordt blootgesteld en scheidt u vervolgens de TA-spier voorzichtig van het scheenbeen door aan de spier te trekken om de extensor digitorum longus of EDL te onthullen. Houd de TA tijdens de procedure vrij van de EDL met behulp van kleine gebogen tangen. Steek de naald van 30 gauge in de lengterichting in de EDL totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt en injecteer 10 microliter van de plasmide-oplossing zoals eerder aangetoond.De EDL-spier moet opzwellen. Meet de dikte van het been bij de EDL en stel de remklauwelektroden in op de gemeten dikte om vijf blokgolfpulsen te leveren zoals eerder uitgelegd. Als u klaar bent, sluit u de incisie met behulp van wegwerpbare 4-0 niet-absorbeerbare nylon hechtingen.Verwijder later de muis uit de neuskegel en laat hem herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 graden Celsius. Dien een geschikt subcutaan analgeticum toe onmiddellijk na de operatie en 12 tot 24 uur na de operatie. Eenmaal hersteld, keert de muis terug naar de thuiskooi.Na de injectie en elektroporatie van het pcDNA3-EGFP plasmide in de TA- en EDL-spieren, werd de GFP-expressie waargenomen die wijst op DNA-opname in de spiervezels. Wanneer de EDL-spiertransfectie-efficiëntie met een lagere vergroting wordt afgebeeld, kan deze worden gevisualiseerd door het verschijnen van groene vezels versus zwarte vezels. De geïnjecteerde en geëlektropoeerde EDLs hadden vergelijkbare tetanische responsen bij 100 Hertz in vergelijking met de controle niet-geïnjecteerde of geëlektroporated spieren.De geïnjecteerde en geëlektropoeerde EDL, de tetanische spierkracht, specifieke tetanische spierkracht, tijd tot piekspanning en halve ontspanningstijd werden niet aangetast in vergelijking met de onaangeroerde controle. Het is belangrijk om de te injecteren spier nauwkeurig te identificeren en de plasmide-oplossing efficiënt af te leveren. Met behulp van dit protocol kunnen een aantal histologische en biochemische metingen worden verricht.Doeleiwit cellulaire lokalisatie, doelgen knockdown, transcriptionele verslaggevers en een reeks weefselkleuring kunnen worden uitgevoerd. Deze techniek is gebruikt om een breed scala aan veranderingen in moleculaire signalering in spieren te identificeren tijdens fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Het onderzoek naar de spiercontractiliteit na genoverdracht is met behulp van deze techniek haalbaar.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Met behulp van de TUNEL Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...