Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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Toutes les expériences utilisant des animaux ont été réalisées au Penn State College of Medicine, approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie, et réalisées conformément aux normes éthiques établies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Des souris femelles C57BL/6 âgées de 12 semaines ont été utilisées pour cette procédure. Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés pour la stéril...

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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

Le transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique amélioré par électroporation est un outil utile et relativement simple pour moduler l’expression des protéines dans le muscle. Nous avons montré les étapes nécessaires pour obtenir un transfert efficace de gènes dans les muscles EDL et TA et démontré que la mesure de la contractilité de l’EDL est viable après la procédure. Cette technique ne nécessite pas de vecteurs viraux plus compliqués et permet de comparer la section transversale ...

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique in vivo est un outil important pour évaluer les changements dans la physiologie des muscles squelettiques et la signalisation moléculaire en modulant l’expression des gènes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Le transfert expérimental de gènes dans le muscle squelettique a été démontré dès 1990 par Wolff et al., où l’ARN et l’ADN ont été transférés avec succès sans électroporation, et l’expression de la luciférase a été maintenue pendant au moins 2 mois10. L’efficacité de transfection relativement faible avec injection seulement est problématique, et Aihara et Miyazaki ont démontré une augmentation du transfert de gènes avec l’électroporation en 1998 en électroporatant une construction pCAGGS-IL-5 dans le muscle tibialis antérieur (TA) et en mesurant l’expression sérique de l’IL-511. Depuis lors, de nombreuses études ont étudié l’efficacité de différentes concentrations d’ADN, volumes et paramètres d’électroporation pour assurer une efficacité maximale du transfert de gènes. Mir et al. ont testé différents paramètres d’électroporation, y compris la tension, le nombre d’impulsions, la durée et la fréquence des impulsions, ainsi que la concentration d’ADN, et ont déterminé qu’une tension, un nombre d’impulsions et une concentration d’ADN plus élevés contribuaient tous à une efficacité accrue de l’électroporation12. Une mise en garde majeure à la tension d’électroporation élevée est que, bien qu’elle facilite l’absorption accrue de l’ADN dans les myofibres, elle provoque également des dommages musculaires, ce qui peut confondre les résultats. Schertzer et al. ont montré que l’électroporation à 200 V causait des dommages dans environ 50% des myofibres 3 jours après l’électroporation, alors que seulement 10% des myofibres étaient endommagés à 50 V13. Nous avons pris en considération les variables affectant le transfert efficace de l’ADN par rapport aux dommages musculaires et avons constaté qu’une tension de 125 V par centimètre de largeur d’étrier est suffisante pour réaliser un transfert de gène efficace.
L’analyse de la section transversale des fibres musculaires et de la contractilité musculaire entière après électroporation sont des aspects importants de la méthode de mesure des changements de taille et de fonction musculaires dus à la modulation des gènes. Nous et d’autres avons déjà démontré que l’électroporation des vecteurs de contrôle seule ne provoque pas une diminution de la zone myofibre. La construction de la protéine fluorescente verte (EGFP) était un indicateur fluorescent utile de la transfection de l’ADN dans ces études13,14. Un certain nombre d’études ont étudié la contractilité in situ de l’AT après électroporation et ont trouvé des résultats variables. Une étude a montré que l’électroporation de 75 V / cm entraînait une réduction d’environ 30% de la force tétanique 3 jours après l’électroporation, et 7 jours après l’électroporation, la force tétanique était revenue au niveau de contrôle, tandis que l’électroporation de 50 V / cm ne compromettait pas la force13,15. Une autre étude a montré qu’il y avait une perte de 30% de la force tétanique 3 h après une électroporation de 180 V / cm, qui a retrouvé les niveaux de force simulée après 7 jours16.
Dans la procédure détaillée suivante, nous démontrons l’injection et l’électroporation d’un plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et extenseur digitorum longus (EDL) de souris. Nous démontrons également que cette méthode n’affecte pas la contractilité musculaire entière de l’EDL. L’objectif est de démontrer une absorption efficace des plasmides dans les myofibres sans entraîner de perte de fonction.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

La modulation transitoire de l’expression génique dans le muscle squelettique murin par électroporation plasmidique est un outil utile pour évaluer la physiologie normale et pathologique. La surexpression ou l’élimination des gènes cibles permet aux chercheurs de manipuler des événements moléculaires individuels et, par conséquent, de mieux comprendre les mécanismes qui ont un impact sur la masse musculaire, le métabolisme musculaire et la contractilité. De plus, l’électroporation des plasmides d’ADN qui codent des étiquettes fluorescentes permet aux chercheurs de mesurer les changements dans la localisation subcellulaire des protéines dans le muscle squelettique in vivo. Une évaluation fonctionnelle clé du muscle squelettique comprend la mesure de la contractilité musculaire. Dans ce protocole, nous démontrons que les études de contractilité musculaire entière sont encore possibles après l’injection d’ADN plasmidique, l’électroporation et la modulation de l’expression génique. L’objectif de cette procédure pédagogique est de démontrer la méthode étape par étape de l’électroporation du plasmide d’ADN dans le muscle squelettique de la souris pour faciliter l’absorption et l’expression dans les myofibres des muscles tibialis antérieur et extenseur digitorum longus, ainsi que de démontrer que la contractilité des muscles squelettiques n’est pas compromise par l’injection et l’électroporation.

L’électroporation pour faciliter le transfert de gènes dans le muscle squelettique est une technique utile utilisée pour évaluer les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons démontré une procédure détaillée, étape par étape, pour réaliser un transfert efficace de gènes dans les muscles TA et EDL. Les différences dans l’efficacité de la transfection se produisent en raison d’un certain nombre de variables. Parmi ces variables figurent les paramètres d’électroporation (impulsions, ten...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Le transfert de gènes médié par électroporation dans les muscles est une technique facile et efficace pour étudier les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons constaté que l’électroporation ne compromet pas la contractilité musculaire. L’électroporation des constructions géniques dans le muscle in vivo est une procédure simple et efficace qui ne nécessite pas un conditionnement plus étendu des constructions géniques en vecteurs viraux.Il est difficile de visualiser, d’isoler et d’injecter l’EDL en raison de son emplacement et de sa petite taille. Pratiquer sur une carcasse de souris et l’injection d’encre biologique telle que l’encre de Chine peut aider à fournir des preuves d’une injection suffisante. Brian Hain, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Avant d’injecter la souris, confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’une pince avec l’absence du réflexe de pincement des orteils, puis transférez la souris sur un cône de nez reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 degrés Celsius pour le reste de la procédure. Une fois la souris placée en décubitus dorsal, retirez les poils des deux membres postérieurs à l’aide de petites tondeuses à cheveux, puis désinfectez la zone d’injection avec une alternance d’éthanol à 70% et de bétadine. Pour l’injection, localisez le tendon tibialis antérieur ou TA visible à travers la peau sur le côté latéral de la jambe inférieure et marquez l’extrémité supérieure du muscle TA.Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 montée sur une micro-seringue de 50 microlitres dans le muscle à un angle peu profond de cinq degrés supérieur d’un à deux millimètres à la jonction myoténdineuse jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle. Appuyez sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour délivrer 50 microlitres de la solution plasmidique dans le muscle. Le muscle devrait gonfler.Réglez la minuterie pendant une minute et mesurez l’épaisseur de la jambe au niveau du muscle TA, puis réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée. Réglez ensuite la tension de l’électroporateur à 12,5 volts par millimètre. Après une minute, placez les électrodes de l’étrier près du membre inférieur sans être trop serrées pour délivrer cinq impulsions d’onde carrées d’une durée de 20 millisecondes et des intervalles de 200 millisecondes.Le muscle devrait se contracter à chaque pouls. Répétez la procédure avec l’autre membre en utilisant le vecteur plasmidique de contrôle. Lorsque vous avez terminé, retirez la souris du cône de nez et laissez la souris récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius.Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage. Avec la souris en position couchée, localisez la crête antérieure de l’os du tibia visuellement et par palpitation douce. Utilisez un scalpel pour faire une incision peu profonde à travers la peau du côté latéral de la crête antérieure du tibia cinq millimètres inférieurs au genou à deux millimètres supérieurs à la jonction myoténdineuse TA.À l’aide de petits ciseaux, disséquez carrément le fascia, exposant le muscle TA, puis séparez doucement le muscle TA du tibia en tirant sur le muscle pour révéler l’extenseur digitorum longus ou EDL. Gardez l’AT dégagé de l’EDL pendant la procédure à l’aide de petites pinces incurvées. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans l’EDL longitudinalement jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle et injectez 10 microlitres de la solution plasmidique comme démontré précédemment.Le muscle EDL devrait gonfler. Mesurez l’épaisseur de la jambe à l’EDL et réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée pour délivrer cinq impulsions d’onde carrées comme expliqué précédemment. Lorsque vous avez terminé, fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon jetables 4-0 non résorbables.Plus tard, retirez la souris du cône de nez et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius. Administrer un analgésique sous-cutané approprié immédiatement après la chirurgie et 12 à 24 heures après la chirurgie. Une fois récupérée, retournez la souris dans la cage d’accueil.Après l’injection et l’électroporation du plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et EDL, l’expression de GFP a été observée indiquant une absorption d’ADN dans les fibres musculaires. Lorsqu’elle est imagée à un grossissement plus faible, l’efficacité de la transfection musculaire EDL pourrait être visualisée par l’apparition de fibres vertes par rapport aux fibres noires. Les EDL injectés et électroporés avaient des réponses tétaniques similaires à 100 Hertz par rapport aux muscles témoins non injectés ou électroporés.L’EDL injecté et électroporé, la force musculaire tétanique, la force musculaire tétanique spécifique, le temps de tension maximale et la moitié du temps de relaxation n’ont pas été compromis par rapport au contrôle intact. Il est important d’identifier avec précision le muscle à injecter et de délivrer efficacement la solution plasmidique. Un certain nombre de mesures histologiques et biochimiques peuvent être effectuées à l’aide de ce protocole.La localisation cellulaire des protéines cibles, l’élimination des gènes cibles, les rapporteurs transcriptionnels et un éventail de colorations tissulaires peuvent être effectués. Cette technique a été utilisée pour identifier une vaste gamme de changements dans la signalisation moléculaire dans les muscles au cours de conditions physiologiques et physiopathologiques. L’étude de la contractilité musculaire suite au transfert de gènes est réalisable en utilisant cette technique.

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Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...