Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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Alle Tierversuche wurden am Penn State College of Medicine durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Penn State University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt wurden. Für dieses Verfahren wurden 12 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle chirurgischen Werkzeuge wurden vor dem Experimentieren auf Sterilität autoklaviert.
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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizi...

Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Skelettmuskulatur wurde bereits 1990 von Wolff et al. demonstriert, wobei sowohl RNA als auch DNA erfolgreich ohne Elektroporation übertragen wurden und die Luciferase-Expression für mindestens 2 Monateaufrechterhalten wurde 10. Die relativ geringe Transfektionseffizienz nur bei Injektion ist problematisch, und Aihara und Miyazaki zeigten1998 einen erhöhten Gentransfer mit Elektroporation, indem sie ein pCAGGS-IL-5-Konstrukt in den Tabialis anterior (TA) -Muskel elektropolierten und die IL-5-Expression 11 des Serums maßen. Seitdem haben viele Studien die Wirksamkeit verschiedener DNA-Konzentrationen, -Volumina und -Elektroporationsparameter untersucht, um eine maximale Gentransfereffizienz zu gewährleisten. Mir et al. testeten verschiedene Elektroporationsparameter, einschließlich Spannung, Pulszahl, Pulsdauer und -frequenz sowie DNA-Konzentration, und stellten fest, dass eine höhere Spannung, Pulszahl und DNA-Konzentration zu einer erhöhten Elektroporationseffizienz beitrugen12. Ein Hauptvorbehalt gegen eine hohe Elektroporationsspannung besteht darin, dass sie zwar eine erhöhte DNA-Aufnahme in Myofasern erleichtert, aber auch Muskelschäden verursacht, die die Ergebnisse beeinträchtigen können. Schertzer et al. zeigten, dass die Elektroporation bei 200 V in etwa 50% der Myofasern 3 Tage nach der Elektroporation Schäden verursachte, während nur 10% der Myofasern bei 50 V13 beschädigt wurden. Wir haben die Variablen berücksichtigt, die den effizienten DNA-Transfer im Vergleich zu Muskelschäden beeinflussen, und festgestellt, dass eine Spannung von 125 V pro Zentimeter Bremssattelbreite ausreicht, um einen effektiven Gentransfer zu erreichen.
Die Analyse der Muskelfaserquerschnittsfläche und der gesamten Muskelkontraktilität nach der Elektroporation sind wichtige Aspekte der Methode zur Messung von Veränderungen der Muskelgröße und -funktion aufgrund der Genmodulation. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Elektroporation von Kontrollvektoren allein keine Abnahme der Myofaserfläche verursacht. Das Konstrukt des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) war in diesen Studien ein nützlicher fluoreszierender Indikator für die DNA-Transfektion13,14. Eine Reihe von Studien haben die In-situ-Kontraktilität der TA nach der Elektroporation untersucht und unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Eine Studie zeigte, dass die 75 V / cm-Elektroporation 3 Tage nach der Elektroporation eine Verringerung der Tetankraft um etwa 30% verursachte, und 7 Tage nach der Elektroporation war die tetanische Kraft wieder auf dem Kontrollniveau, während die 50 V / cm-Elektroporation die Kraft13,15 nicht beeinträchtigte. Eine andere Studie zeigte, dass es einen 30% igen Verlust der Tetankraft 3 h nach 180 V / cm Elektroporation gab, die sich nach 7 Tagen16 auf die Scheinkraftniveaus erholte.
Im folgenden detaillierten Verfahren demonstrieren wir die Injektion und Elektroporation eines pcDNA3-EGFP-Plasmids in den TA- und Extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von Mäusen. Wir zeigen auch, dass diese Methode die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels nicht beeinflusst. Ziel ist es, eine effiziente Plasmidaufnahme in Myofasern zu demonstrieren, ohne einen Funktionsverlust zu verursachen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.

Elektroporation zur Erleichterung des Gentransfers in der Skelettmuskulatur ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu bewerten. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Verfahren demonstriert, um einen effizienten Gentransfer sowohl in den TA- als auch in den EDL-Muskeln zu erreichen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz treten aufgrund einer Reihe von Variablen auf. Zu diesen Variablen gehören Elektroporationsparameter (Impulse, Spannung, Pulsdauer usw.), die Größe des Genkons...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Der elektroporationsvermittelte Gentransfer im Muskel ist eine einfache und effiziente Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Elektroporation die Muskelkontraktilität nicht beeinträchtigt. Die Elektroporation von Genkonstrukten in Muskeln in vivo ist ein einfaches und effizientes Verfahren, das keine umfangreichere Verpackung von Genkonstrukten in virale Vektoren erfordert.Es ist schwierig, die EDL aufgrund ihrer Lage und geringen Größe zu visualisieren, zu isolieren und zu injizieren. Das Üben auf einem Mauskadaver und das Einspritzen von biologischer Tinte wie Indentinte kann dazu beitragen, den Nachweis einer ausreichenden Injektion zu erbringen. Das Verfahren wird von Brian Hain, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert.Bevor Sie die Maus injizieren, bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie mit einer Pinzette ohne den Zehenquetschreflex und übertragen Sie die Maus dann für den Rest des Eingriffs auf einen Nasenkegel, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 Grad Celsius ruht. Sobald die Maus in Rückenlage ist, entfernen Sie die Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen und desinfizieren Sie dann den Injektionsbereich mit abwechselnd 70% Ethanol und Betadin. Für die Injektion lokalisieren Sie die Tibialis-Anterior- oder TA-Sehne, die durch die Haut auf der lateralen Seite des Unterschenkels sichtbar ist, und markieren Sie das obere Ende des TA-Muskels.Führen Sie dann eine 30-Gauge-Nadel ein, die auf einer 50-Mikroliter-Mikrospritze montiert ist, in einem flachen Fünf-Grad-Winkel von ein bis zwei Millimetern über der myotendinösen Verbindung in den Muskel, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht. Drücken Sie den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 50 Mikroliter der Plasmidlösung in den Muskel zu bringen. Der Muskel sollte anschwellen.Stellen Sie den Timer auf eine Minute ein und messen Sie die Dicke des Beines am TA-Muskel, dann stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein. Stellen Sie dann die Elektroporatorspannung auf 12,5 Volt pro Millimeter ein. Platzieren Sie die Bremssattelelektroden nach einer Minute eng um die untere Extremität, ohne zu eng zu sein, um fünf Rechteckwellenimpulse mit einer Dauer von 20 Millisekunden und Intervallen von 200 Millisekunden zu liefern.Der Muskel sollte mit jedem Puls zucken. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Extremität unter Verwendung des Kontrollplasmidvektors. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Maus vom Nasenkegel und lassen Sie die Maus auf einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizkissen genesen.Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück. Mit der Maus in Rückenlage lokalisieren Sie den vorderen Kamm des Tibiaknochens visuell und durch sanftes Herzklopfen. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen flachen Schnitt durch die Haut auf der lateralen Seite des Tibia-Vorderkamms zu machen, der fünf Millimeter niedriger als das Knie ist und zwei Millimeter über der TA-myotendinösen Verbindung liegt.Sezieren Sie mit Hilfe einer kleinen Schere stumpf die Faszie, legen Sie den TA-Muskel frei, und trennen Sie dann den TA-Muskel sanft von der Tibia, indem Sie den Muskel ziehen, um den Extensor digitorum longus oder EDL freizulegen. Halten Sie die TA während des Eingriffs mit einer kleinen gekrümmten Pinzette von der EDL fern. Führen Sie die 30-Gauge-Nadel in Längsrichtung in die EDL ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht, und injizieren Sie 10 Mikroliter der Plasmidlösung, wie zuvor gezeigt.Der EDL-Muskel sollte anschwellen. Messen Sie die Dicke des Beines am EDL und stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein, um fünf Rechteckwellenimpulse zu liefern, wie zuvor erläutert. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie den Einschnitt mit Einweg-4-0 nicht resorbierbaren Nylonnähten.Entfernen Sie später die Maus vom Nasenkegel und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizkissen erholen. Verabreichen Sie ein geeignetes subkutanes Analgetikum unmittelbar nach der Operation und 12 bis 24 Stunden nach der Operation. Nach der Wiederherstellung kehrt die Maus in den Heimkäfig zurück.Nach der Injektion und Elektroporation des pcDNA3-EGFP-Plasmids in die TA- und EDL-Muskeln wurde die GFP-Expression beobachtet, die auf eine DNA-Aufnahme in den Muskelfasern hinweist. Bei einer geringeren Vergrößerung konnte die EDL-Muskeltransfektionseffizienz durch das Auftreten von grünen Fasern im Vergleich zu schwarzen Fasern visualisiert werden. Die injizierten und elektroporated EDLs hatten ähnliche tetanische Reaktionen bei 100 Hertz im Vergleich zu den nicht injizierten oder elektroporated Kontrollmuskeln.Die injizierte und elektropolierte EDL, die tetanische Muskelkraft, die spezifische tetanische Muskelkraft, die Zeit bis zur Spitzenspannung und die halbe Entspannungszeit wurden im Vergleich zur unberührten Kontrolle nicht beeinträchtigt. Es ist wichtig, den zu injizierenden Muskel genau zu identifizieren und die Plasmidlösung effizient zu liefern. Eine Reihe von histologischen und biochemischen Messungen können mit diesem Protokoll durchgeführt werden.Die zelluläre Lokalisierung von Zielproteinen, der Knockdown von Zielgenen, transkriptionelle Reporter und eine Reihe von Gewebefärbungen können durchgeführt werden. Diese Technik wurde verwendet, um eine Vielzahl von Veränderungen der molekularen Signalgebung im Muskel unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu identifizieren. Die Untersuchung der Muskelkontraktilität nach Gentransfer ist mit dieser Technik möglich.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Forschung

Biologie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Optimierte Reinigung von Plasmid-DNA aus prokaryontischen Kulturen

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...