Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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कोई नहीं

जानवरों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग पेन स्टेट कॉलेज ऑफ मेडिसिन में किए गए थे, जिसे पेन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और हेलसिंकी की 1964 की घोषणा औ?...

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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा बढ़ाए गए कंकाल की मांसपेशियों में विवो जीन हस्तांतरण मांसपेशियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए एक उपयोगी और अपेक्षाकृत सरल उपकरण है। हमने ईडीएल और टीए मां...

विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करके कंकाल की मांसपेशी शरीर विज्ञान और आणविक सिग्नलिंग में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . कंकाल की मांसपेशियों में प्रायोगिक जीन हस्तांतरण वोल्फ एट अल द्वारा 1990 की शुरुआत में प्रदर्शित किया गया था, जहां आरएनए और डीएनए दोनों को इलेक्ट्रोपोरेशन के बिना सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया था, और ल्यूसिफेरेज़ अभिव्यक्ति को कम से कम 2 महीने10 तक बनाए रखा गया था। इंजेक्शन के साथ अपेक्षाकृत कम अभिकर्मक दक्षता केवल समस्याग्रस्त है, और ऐहारा और मियाज़ाकी ने 1998 में पीसीएजीजीएस-आईएल -5 निर्माण को टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों में इलेक्ट्रोपोरेट करके और सीरम आईएल -5 अभिव्यक्ति11 को मापकर इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ जीन हस्तांतरण में वृद्धि का प्रदर्शन किया। उस समय से, कई अध्ययनों ने अधिकतम जीन हस्तांतरण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न डीएनए सांद्रता, वॉल्यूम और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों की प्रभावकारिता की जांच की है। वोल्टेज, पल्स नंबर, पल्स अवधि और आवृत्ति, साथ ही डीएनए एकाग्रता सहित विभिन्न इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का परीक्षण किया, और यह निर्धारित किया कि अधिक वोल्टेज, पल्स संख्या और डीएनए एकाग्रता सभी ने इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता में वृद्धि में योगदान दिया12. उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि, जबकि यह मायोफाइबर में डीएनए तेज में वृद्धि की सुविधा प्रदान करता है, यह मांसपेशियों को नुकसान भी पहुंचाता है, जो परिणामों को भ्रमित कर सकता है। शर्टज़र एट अल ने दिखाया कि 200 वी पर इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों बाद लगभग 50% मायोफाइबर में नुकसान पहुंचाया, जबकि 50 वी13 पर केवल 10% मायोफाइबर क्षतिग्रस्त हो गए। हमने कुशल डीएनए हस्तांतरण बनाम मांसपेशियों की क्षति को प्रभावित करने वाले चर को ध्यान में रखा है और पाया है कि कैलिपर चौड़ाई के 125 वी प्रति सेंटीमीटर का वोल्टेज प्रभावी जीन हस्तांतरण को पूरा करने के लिए पर्याप्त है।
मांसपेशी फाइबर क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र का विश्लेषण और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन जीन मॉडुलन के कारण मांसपेशियों के आकार और कार्य में परिवर्तन को मापने के लिए विधि के महत्वपूर्ण पहलू हैं। हमने और अन्य लोगों ने पहले प्रदर्शित किया है कि अकेले नियंत्रण वैक्टर के इलेक्ट्रोपोरेशन से मायोफाइबर क्षेत्र में कमी नहीं होती है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) निर्माण इन अध्ययनों13,14 में डीएनए अभिकर्मक का एक उपयोगी फ्लोरोसेंट संकेतक था। कई अध्ययनों ने इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टीए की सीटू सिकुड़न में जांच की है और अलग-अलग परिणाम पाए हैं। एक अध्ययन से पता चला है कि 75 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों के बाद टेटैनिक बल में लगभग 30% की कमी का कारण बना, और 7 दिनों के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन तक, टेटैनिक बल नियंत्रण स्तर पर वापस आ गया, जबकि 50 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने बल13,15 से समझौता नहीं किया। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि 180 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टेटैनिक बल 3 घंटे का 30% नुकसान हुआ था, जो 7 दिनों16 दिनों के बाद शम बल के स्तर पर ठीक हो गया था।
निम्नलिखित विस्तृत प्रक्रिया में, हम चूहों के टीए और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों में पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रदर्शन करते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि ईडीएल पूरे मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित नहीं करती है। इसका उद्देश्य फ़ंक्शन के नुकसान के बिना मायोफाइबर में कुशल प्लास्मिड अपटेक का प्रदर्शन करना है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा म्यूरिन कंकाल की मांसपेशियों में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन सामान्य और पैथोलॉजिकल फिजियोलॉजी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। लक्ष्य जीन की ओवरएक्सप्रेशन या नॉकडाउन जांचकर्ताओं को व्यक्तिगत आणविक घटनाओं में हेरफेर करने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार, मांसपेशियों, मांसपेशियों के चयापचय और सिकुड़न को प्रभावित करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट टैग को एन्कोड करने वाले डीएनए प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन जांचकर्ताओं को विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन को मापने की अनुमति देता है। कंकाल की मांसपेशियों के एक प्रमुख कार्यात्मक मूल्यांकन में मांसपेशियों की सिकुड़न का माप शामिल है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन और जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन अध्ययन अभी भी संभव हैं। इस अनुदेशात्मक प्रक्रिया का लक्ष्य माउस कंकाल की मांसपेशियों में डीएनए प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन की चरण-दर-चरण विधि का प्रदर्शन करना है ताकि टिबियलिस पूर्वकाल और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस मांसपेशियों के मायोफाइबर में तेज और अभिव्यक्ति की सुविधा मिल सके, साथ ही यह प्रदर्शित किया जा सके कि कंकाल की मांसपेशी संकुचन इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा समझौता नहीं किया जाता है।

कंकाल की मांसपेशियों में जीन हस्तांतरण की सुविधा के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन एक उपयोगी तकनीक है जिसका उपयोग मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। हमने टीए और ईडी...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन चूहों में मांसपेशियों के संकुचन से समझौता किए बिना जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने का एक व्यवहार्य तरीका है।

माउस कंकाल की मांसपेशी में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

मांसपेशियों में इलेक्ट्रोपोरेशन-मध्यस्थता जीन स्थानांतरण मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक आसान और कुशल तकनीक है। हमने पाया कि इलेक्ट्रोपोरेशन मांसपेशियों के संकुचन से समझौता नहीं करता है। विवो में मांसपेशियों में जीन निर्माणों का इलेक्ट्रोपोरेशन एक सरल और कुशल प्रक्रिया है जिसे वायरल वैक्टर में जीन निर्माणों की अधिक व्यापक पैकेजिंग की आवश्यकता नहीं होती है।इसके स्थान और छोटे आकार के कारण ईडीएल की कल्पना करना, अलग करना और इंजेक्ट करना मुश्किल है। माउस शव पर अभ्यास करना और भारत स्याही जैसे जैविक स्याही के इंजेक्शन से पर्याप्त इंजेक्शन के सबूत प्रदान करने में सहायता मिल सकती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन ब्रायन हैन, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्ट डॉक्टर होगा।माउस इंजेक्शन से पहले, पैर की अंगुली चुटकी पलटा की अनुपस्थिति के साथ संदंश का उपयोग कर संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान की पुष्टि, तो प्रक्रिया के बाकी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी पानी की थाली पर आराम एक नाक शंकु के लिए माउस हस्तांतरण। एक बार माउस को लापरवाह स्थिति में रखा जाता है, तो छोटे बाल क्लिपर्स का उपयोग करके दोनों हिंद अंगों से बालों को हटा दें, फिर 70% इथेनॉल और बीटाडीन के साथ इंजेक्शन क्षेत्र को साफ करें। इंजेक्शन के लिए निचले पैर के पार्श्व पक्ष पर त्वचा के माध्यम से दिखाई देने वाले टिबियलिस पूर्वकाल या टीए कण्डरा का पता लगाएं और टीए मांसपेशियों के बेहतर छोर को चिह्नित करें।फिर 50-माइक्रोलीटर माइक्रो सिरिंज पर घुड़सवार 30-गेज सुई को उथले पांच डिग्री के कोण पर मांसपेशियों में एक से दो मिलीमीटर तक मायोटेंडिनस जंक्शन से बेहतर डालें जब तक कि सुई मांसपेशियों के बेहतर छोर तक नहीं पहुंच जाती। मांसपेशियों में प्लास्मिड समाधान के 50 माइक्रोलीटर देने के लिए इंजेक्शन पथ के साथ सुई को धीरे-धीरे वापस लेते हुए सवार को दबाएं। मांसपेशियों में सूजन आनी चाहिए।एक मिनट के लिए टाइमर सेट करें और टीए मांसपेशियों में पैर की मोटाई को मापें, फिर कैलिपर इलेक्ट्रोड को मापा मोटाई पर सेट करें। फिर इलेक्ट्रोपोरेटर वोल्टेज को 12.5 वोल्ट प्रति मिलीमीटर पर सेट करें। एक मिनट के बाद, कैलिपर इलेक्ट्रोड को 20-मिलीसेकंड अवधि और 200-मिलीसेकंड अंतराल के साथ पांच वर्ग तरंग दालों को वितरित करने के लिए अत्यधिक तंग किए बिना निचले अंग के चारों ओर बारीकी से रखें।मांसपेशियों को प्रत्येक नाड़ी के साथ चिकोटी चाहिए। नियंत्रण प्लास्मिड वेक्टर का उपयोग करके दूसरे अंग के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। जब किया जाता है, तो नाक शंकु से माउस को हटा दें और माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग पैड पर ठीक होने की अनुमति दें।एक बार बरामद होने के बाद, माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें। एक लापरवाह स्थिति में माउस के साथ, टिबिया हड्डी पूर्वकाल शिखा नेत्रहीन और कोमल धड़कन के माध्यम से पता लगाने। टिबिया पूर्वकाल शिखा के पार्श्व पक्ष पर त्वचा के माध्यम से एक उथले चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग घुटने से पांच मिलीमीटर से दो मिलीमीटर तक टीए मायोटेंडिनस जंक्शन से बेहतर है।छोटी कैंची की मदद से प्रावरणी को स्पष्ट रूप से विच्छेदित करें, टीए मांसपेशियों को उजागर करें, और फिर एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस या ईडीएल को प्रकट करने के लिए मांसपेशियों को खींचकर धीरे-धीरे टिबिया से टीए मांसपेशियों को अलग करें। छोटे घुमावदार संदंश का उपयोग कर प्रक्रिया के दौरान ईडीएल से टीए स्पष्ट रखें। ईडीएल में अनुदैर्ध्य रूप से 30-गेज सुई डालें जब तक कि सुई मांसपेशियों के बेहतर छोर तक न पहुंच जाए और पहले दिखाए गए प्लास्मिड समाधान के 10 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें।ईडीएल की मांसपेशियों में सूजन होनी चाहिए। ईडीएल में पैर की मोटाई को मापें और कैलिपर इलेक्ट्रोड को मापा मोटाई पर सेट करें ताकि पहले समझाया गया पांच वर्ग तरंग दालों को वितरित किया जा सके। जब किया जाता है, तो डिस्पोजेबल 4-0 गैर-अवशोषित नायलॉन टांके का उपयोग करके चीरा बंद करें।बाद में नाक शंकु से माउस को हटा दें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग पैड पर ठीक होने की अनुमति दें। सर्जरी के तुरंत बाद और सर्जरी के 12 से 24 घंटे बाद एक उपयुक्त चमड़े के नीचे एनाल्जेसिक का प्रशासन करें। एक बार बरामद होने के बाद माउस को घर के पिंजरे में वापस कर दें।टीए और ईडीएल मांसपेशियों में पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, जीएफपी अभिव्यक्ति मांसपेशियों के तंतुओं में डीएनए तेज का संकेत देती है। जब कम आवर्धन पर चित्रित किया जाता है, तो ईडीएल मांसपेशी अभिकर्मक दक्षता को हरे फाइबर बनाम काले फाइबर की उपस्थिति के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल में नियंत्रण गैर-इंजेक्शन या इलेक्ट्रोपोरेटेड मांसपेशियों की तुलना में 100 हर्ट्ज पर समान टेटैनिक प्रतिक्रियाएं थीं।इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल, टेटेनिक मांसपेशी बल, विशिष्ट टेटेनिक मांसपेशी बल, चोटी के तनाव का समय, और आधा विश्राम समय अछूता नियंत्रण की तुलना में समझौता नहीं किया गया था। इंजेक्शन लगाने के लिए मांसपेशियों की सटीक पहचान करना और प्लास्मिड समाधान को कुशलतापूर्वक वितरित करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई हिस्टोलॉजिकल और जैव रासायनिक माप किए जा सकते हैं।लक्ष्य प्रोटीन सेलुलर स्थानीयकरण, लक्ष्य जीन नॉकडाउन, ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर, और ऊतक धुंधला होने की एक सरणी आयोजित की जा सकती है। इस तकनीक का उपयोग शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के दौरान मांसपेशियों में आणविक सिग्नलिंग में परिवर्तन की एक विशाल सरणी की पहचान करने के लिए किया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके जीन स्थानांतरण के बाद मांसपेशियों के संकुचन की जांच संभव है।

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

प्लास्मिड डीएनए के ई. कोलाई में परिवर्तन हीट शॉक विधि का प्रयोग

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

स्तनधारी कंकाल का उपयोग स्नायु के डीएनए अभिकर्मक Vivo में Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

प्राथमिक संस्कृति और Corti के murine अंग के प्लाज्मिड electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Prokaryotic संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए के सुव्यवस्थित शोधन

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से Mitochondrial अलगाव

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से progenitors के शोधन

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

लेजर प्रवृत्त Zebrafish भ्रूण कंकाल की मांसपेशी की चोट

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

माउस कंकाल की मांसपेशी में जांच और डीएनए की क्षति के विश्लेषण<em&gt; बगल में</em&gt; TUNEL के विधि का प्रयोग

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

माउस मूत्राशय को प्लाज्मिड डीएनए डिलिवरी के उपंयास विधि Electroporation द्वारा Urothelium

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...