Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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Tutti gli esperimenti che utilizzano animali sono stati eseguiti presso il Penn State College of Medicine, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Penn State University, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Per questa procedura sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 12 settimane. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati autoclavati per la sterilità prima della sperimentazione.
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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

Il trasferimento genico in vivo nel muscolo scheletrico potenziato dall'elettroporazione è uno strumento utile e relativamente semplice per modulare l'espressione proteica nel muscolo. Abbiamo mostrato i passaggi necessari per ottenere un trasferimento genico efficiente nei muscoli EDL e TA e dimostrato che la misurazione della contrattilità dell'EDL è praticabile seguendo la procedura. Questa tecnica non richiede vettori virali più complicati e consente il confronto trasfettato e non trasfettato dell'area d...

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico in vivo è uno strumento importante per valutare i cambiamenti nella fisiologia del muscolo scheletrico e nella segnalazione molecolare modulando l'espressione genica in una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Il trasferimento genico sperimentale nel muscolo scheletrico è stato dimostrato già nel 1990 da Wolff et al., dove sia l'RNA che il DNA sono stati trasferiti con successo senza elettroporazione e l'espressione della luciferasi è stata mantenuta per almeno 2 mesi10. L'efficienza di trasfezione relativamente bassa con la sola iniezione è problematica, e Aihara e Miyazaki hanno dimostrato un aumento del trasferimento genico con l'elettroporazione nel 1998 elettroporando un costrutto pCAGGS-IL-5 nel muscolo tibiale anteriore (TA) e misurando l'espressione sierica di IL-511. Da quel momento, molti studi hanno studiato l'efficacia di diverse concentrazioni di DNA, volumi e parametri di elettroporazione per garantire la massima efficienza di trasferimento genico. Mir et al. hanno testato diversi parametri di elettroporazione, tra cui tensione, numero di impulsi, durata e frequenza dell'impulso, nonché concentrazione di DNA, e hanno determinato che una maggiore tensione, numero di impulsi e concentrazione di DNA hanno contribuito ad aumentare l'efficienza dell'elettroporazione12. Un avvertimento importante per l'alta tensione di elettroporazione è che, mentre facilita l'aumento dell'assorbimento del DNA nelle miofibre, provoca anche danni muscolari, che possono confondere i risultati. Schertzer et al. hanno dimostrato che l'elettroporazione a 200 V ha causato danni in circa il 50% delle miofibre 3 giorni dopo l'elettroporazione, mentre solo il 10% delle miofibre è stato danneggiato a 50 V13. Abbiamo preso in considerazione le variabili che influenzano il trasferimento efficiente del DNA rispetto al danno muscolare e abbiamo scoperto che una tensione di 125 V per centimetro di larghezza della pinza è sufficiente per realizzare un efficace trasferimento genico.
L'analisi dell'area della sezione trasversale delle fibre muscolari e la contrattilità dell'intero muscolo dopo l'elettroporazione sono aspetti importanti del metodo per misurare i cambiamenti nelle dimensioni e nella funzione muscolare dovuti alla modulazione genica. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l'elettroporazione dei vettori di controllo da sola non causa una diminuzione dell'area della miofibra. Il costrutto della proteina fluorescente verde (EGFP) è stato un utile indicatore fluorescente della trasfezione del DNA in questi studi13,14. Numerosi studi hanno studiato la contrattilità in situ del TA dopo elettroporazione e hanno trovato risultati variabili. Uno studio ha dimostrato che l'elettroporazione a 75 V / cm ha causato una riduzione di circa il 30% della forza tetanica 3 giorni dopo l'elettroporazione, e da 7 giorni dopo l'elettroporazione, la forza tetanica è tornata al livello di controllo, mentre l'elettroporazione a 50 V / cm non ha compromesso la forza13,15. Un altro studio ha dimostrato che c'è stata una perdita del 30% di forza tetanica 3 ore dopo 180 V / cm di elettroporazione, che è tornata ai livelli di forza fittizia dopo 7 giorni16.
Nella seguente procedura dettagliata, dimostriamo l'iniezione e l'elettroporazione di un plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed estensore digitorum longus (EDL) dei topi. Dimostriamo anche che questo metodo non influisce sulla contrattilità del muscolo intero EDL. L'obiettivo è dimostrare un efficace assorbimento del plasmide nelle miofibre senza causare perdita di funzione.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

La modulazione transitoria dell'espressione genica nel muscolo scheletrico murino mediante elettroporazione plasmidica è uno strumento utile per valutare la fisiologia normale e patologica. La sovraespressione o l'abbattimento dei geni bersaglio consente ai ricercatori di manipolare singoli eventi molecolari e, quindi, comprendere meglio i meccanismi che influenzano la massa muscolare, il metabolismo muscolare e la contrattilità. Inoltre, l'elettroporazione dei plasmidi del DNA che codificano i tag fluorescenti consente ai ricercatori di misurare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine nel muscolo scheletrico in vivo. Una valutazione funzionale chiave del muscolo scheletrico include la misurazione della contrattilità muscolare. In questo protocollo, dimostriamo che gli studi di contrattilità dell'intero muscolo sono ancora possibili dopo l'iniezione di DNA plasmidico, l'elettroporazione e la modulazione dell'espressione genica. L'obiettivo di questa procedura didattica è dimostrare il metodo passo-passo dell'elettroporazione del plasmide del DNA nel muscolo scheletrico del topo per facilitare l'assorbimento e l'espressione nelle miofibre dei muscoli tibiale anteriore ed estensore digitorum longus, nonché dimostrare che la contrattilità del muscolo scheletrico non è compromessa dall'iniezione e dall'elettroporazione.

L'elettroporazione per facilitare il trasferimento genico nel muscolo scheletrico è una tecnica utile utilizzata per valutare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo dimostrato una procedura dettagliata e passo-passo per realizzare un trasferimento genico efficiente sia nei muscoli TA che EDL. Le differenze nell'efficienza di trasfezione si verificano a causa di una serie di variabili. Tra queste variabili ci sono i parametri di elettroporazione (impulsi, tensione, durata dell'impulso, ecc.), La dimensione del...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Il trasferimento genico mediato dall'elettroporazione nel muscolo è una tecnica facile ed efficiente per studiare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo scoperto che l'elettroporazione non compromette la contrattilità muscolare. L'elettroporazione di costrutti genici in muscolo in vivo è una procedura semplice ed efficiente che non richiede un confezionamento più esteso di costrutti genici in vettori virali.È difficile visualizzare, isolare e iniettare l'EDL a causa della sua posizione e delle sue piccole dimensioni. Praticare su una carcassa di topo e l'iniezione di inchiostro biologico come l'inchiostro dell'India può aiutare a fornire prove di iniezione sufficiente. A dimostrare la procedura sarà Brian Hain, un post doc del mio laboratorio.Prima di iniettare il topo, confermare il piano chirurgico dell'anestesia usando una pinza con l'assenza del riflesso del pizzico della punta, quindi trasferire il mouse su un cono nasale appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 gradi Celsius per il resto della procedura. Una volta che il topo è posto in posizione supina, rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori utilizzando piccoli tagliacapelli, quindi disinfettare l'area di iniezione con alternanza di etanolo al 70% e betadina. Per l'iniezione individuare il tibiale anteriore o tendine TA visibile attraverso la pelle sul lato laterale della parte inferiore della gamba e segnare l'estremità superiore del muscolo TA.Quindi inserire un ago calibro 30 montato su una micro siringa da 50 microlitri nel muscolo con un angolo di cinque gradi poco profondo da uno a due millimetri superiore alla giunzione miotendinea fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo. Premere lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per fornire 50 microlitri della soluzione plasmidica nel muscolo. Il muscolo dovrebbe gonfiarsi.Impostare il timer per un minuto e misurare lo spessore della gamba sul muscolo TA, quindi impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato. Quindi impostare la tensione dell'elettroporatore a 12,5 volt per millimetro. Dopo un minuto, posizionare gli elettrodi della pinza vicino all'arto inferiore senza essere eccessivamente stretti per fornire cinque impulsi a onda quadra con una durata di 20 millisecondi e intervalli di 200 millisecondi.Il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso. Ripetere la procedura con l'altro arto utilizzando il vettore plasmidico di controllo. Al termine, rimuovere il mouse dal cono del naso e consentire al mouse di recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius.Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia. Con il topo in posizione supina, individuare la cresta anteriore dell'osso della tibia visivamente e attraverso una palpitazione delicata. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione poco profonda attraverso la pelle sul lato laterale della cresta anteriore della tibia cinque millimetri inferiore al ginocchio a due millimetri superiore alla giunzione miotendinea TA.Con l'aiuto di piccole forbici seziona senza mezzi termini la fascia, esponendo il muscolo TA, e quindi separa delicatamente il muscolo TA dalla tibia tirando delicatamente il muscolo per rivelare l'estensore digitorum longus o EDL. Mantenere l'TA chiaro dall'EDL durante la procedura utilizzando una piccola pinza curva. Inserire l'ago calibro 30 nell'EDL longitudinalmente fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo e iniettare 10 microlitri della soluzione plasmidica come dimostrato in precedenza.Il muscolo EDL dovrebbe gonfiarsi. Misurare lo spessore della gamba all'EDL e impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato per fornire cinque impulsi a onda quadra come spiegato in precedenza. Al termine, chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon monouso 4-0 non riassorbibili.Successivamente rimuovere il mouse dal cono del naso e consentirgli di recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius. Somministrare un analgesico sottocutaneo appropriato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e da 12 a 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Una volta recuperato riportare il mouse alla gabbia di casa.Dopo l'iniezione e l'elettroporazione del plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed EDL, è stata osservata l'espressione GFP che indica l'assorbimento del DNA nelle fibre muscolari. Quando viene ripreso con un ingrandimento inferiore, l'efficienza di trasfezione muscolare EDL potrebbe essere visualizzata attraverso l'aspetto di fibre verdi rispetto alle fibre nere. Gli EDL iniettati ed elettroporati hanno avuto risposte tetaniche simili a 100 Hertz rispetto ai muscoli di controllo non iniettati o elettroporati.L'EDL iniettato ed elettroporato, la forza muscolare tetanica, la forza muscolare tetanica specifica, il tempo di massima tensione e il tempo di mezzo rilassamento non sono stati compromessi rispetto al controllo intatto. È importante identificare con precisione il muscolo da iniettare e fornire in modo efficiente la soluzione plasmidica. Un certo numero di misurazioni istologiche e biochimiche possono essere effettuate utilizzando questo protocollo.È possibile condurre la localizzazione cellulare della proteina bersaglio, l'abbattimento del gene bersaglio, i reporter trascrizionali e una serie di colorazioni tissutali. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare una vasta gamma di cambiamenti nella segnalazione molecolare nel muscolo durante condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Lo studio della contrattilità muscolare a seguito del trasferimento genico è fattibile utilizzando questa tecnica.

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Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...