Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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동물을 이용한 모든 실험은 Penn State College of Medicine에서 수행되었으며, Penn State University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 절차에 사용하였다. 모든 수술 도구는 실험 전에 불임성을 위해 오토클레이브되었다.
1. TA 및 EDL 주입 / 전기 천?...

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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

전기천공에 의해 강화된 골격근에서의 생체내 유전자 전달은 근육에서 단백질 발현을 조절하기 위한 유용하고 비교적 간단한 도구이다. 우리는 EDL 및 TA 근육에서 효율적인 유전자 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 보여 주었고 EDL의 수축성 측정이 절차에 따라 실행 가능하다는 것을 입증했습니다. 이 기술은 더 복잡한 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으며, 단일 근육에서 형질감염된 근?...

생체 내에서 골격근으로의 플라스미드 DNA 전기천공은 다양한 생리학적 및 병리생리학적 조건에서 유전자 발현을 조절함으로써 골격근 생리학 및 분자 신호전달의 변화를 평가하기 위한 중요한 도구이다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 골격근으로의 실험적 유전자 전달은 Wolff et al.에 의해 1990 년 초에 입증되었으며, RNA와 DNA는 모두 전기 천공없이 성공적으로 전달되었으며 루시퍼라제 발현은 적어도 2 개월 동안10 년 동안 유지되었습니다. 주사만으로 비교적 낮은 형질감염 효율은 문제가 있으며, 아이하라와 미야자키는 1998년 pCAGGS-IL-5 구축물을 경골 전방(TA) 근육으로 전기천공하고 혈청 IL-5 발현11을 측정함으로써 전기천공을 통한 유전자 전달 증가를 입증했다. 그 이후로 많은 연구가 최대의 유전자 전달 효율을 보장하기 위해 다양한 DNA 농도, 부피 및 전기 천공 매개 변수의 효능을 조사했습니다. Mir et al.은 DNA 농도뿐만 아니라 전압, 펄스 수, 펄스 지속 시간 및 주파수를 포함한 다양한 전기 천공 매개 변수를 테스트하고 더 큰 전압, 펄스 수 및 DNA 농도가 모두 전기 천공 효율 증가에 기여한다는 것을 확인했습니다12. 높은 전기 천공 전압에 대한 주요 경고는 근섬유로의 DNA 흡수 증가를 촉진하지만 근육 손상을 일으켜 결과를 혼란스럽게 할 수 있다는 것입니다. Schertzer et al. 200V에서의 전기 천공은 전기 천공 후 3 일 후에 근섬유의 약 50 %에서 손상을 일으킨 반면, 근섬유의 10 %만이 50V13에서 손상되었음을 보여주었습니다. 우리는 근육 손상에 비해 효율적인 DNA 전달에 영향을 미치는 변수를 고려했으며 캘리퍼 너비의 센티미터 당 125V의 전압이 효과적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하다는 것을 발견했습니다.
전기천공 후 근육 섬유 단면적 및 전체 근육 수축성의 분석은 유전자 조절에 의한 근육 크기 및 기능의 변화를 측정하는 방법의 중요한 측면이다. 우리와 다른 사람들은 이전에 제어 벡터의 전기 천공만으로는 근섬유 영역의 감소를 일으키지 않는다는 것을 입증했습니다. 녹색 형광 단백질(EGFP) 구축물은 이들 연구13,14에서 DNA 형질감염의 유용한 형광 지표였다. 많은 연구가 전기 천공 후 TA의 계내 수축성을 조사하고 다양한 결과를 발견했습니다. 한 연구에 따르면 75V/cm 전기천공은 전기천공 후 3일 동안 파상력이 약 30% 감소했으며, 전기천공 후 7일까지 파타닉 파워가 대조군 수준으로 돌아간 반면, 50V/cm 전기천공은 힘13,15를 손상시키지 않았다. 또 다른 연구에 따르면 180V / cm 전기 천공 후 3 시간 후에 파타닉 힘이 30 % 손실되어 7 일16 일 후에 가짜 힘 수준으로 회복되었습니다.
다음의 상세한 절차에서, 우리는 마우스의 TA 및 신근 디지토럼 롱구스 (EDL) 근육에서 pcDNA3-EGFP 플라스미드의 주사 및 전기천공을 입증한다. 우리는 또한이 방법이 EDL 전체 근육 수축성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증합니다. 목표는 기능 손실을 일으키지 않고 근섬유로의 효율적인 플라스미드 흡수를 입증하는 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

플라스미드 전기천공에 의한 뮤린 골격근에서의 일시적 유전자 발현 조절은 정상 및 병리학적 생리학을 평가하는데 유용한 도구이다. 표적 유전자의 과발현 또는 녹다운을 통해 조사자는 개별 분자 사건을 조작할 수 있으며, 따라서 근육 질량, 근육 대사 및 수축성에 영향을 미치는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한, 형광 태그를 인코딩하는 DNA 플라스미드의 전기천공은 조사자가 생체 내에서 골격근에서 단백질의 세포내 국소화의 변화를 측정할 수 있게 한다. 골격근의 주요 기능 평가에는 근육 수축성의 측정이 포함됩니다. 이 프로토콜에서, 우리는 플라스미드 DNA 주입, 전기천공 및 유전자 발현 조절 후에도 전체 근육 수축성 연구가 여전히 가능하다는 것을 입증한다. 이 교육 절차의 목표는 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 근육의 근섬유에서 흡수 및 발현을 촉진하기 위해 마우스 골격근으로 DNA 플라스미드 전기 천공의 단계별 방법을 시연하고 골격근 수축성이 주입 및 전기 천공에 의해 손상되지 않는다는 것을 입증하는 것입니다.

골격근에서 유전자 전달을 촉진하기 위한 전기천공은 근육 생리학의 변화를 평가하는데 사용되는 유용한 기술이다. 우리는 TA 및 EDL 근육 모두에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기위한 상세하고 단계별 절차를 입증했습니다. 형질감염 효율의 차이는 다수의 변수로 인해 발생한다. 이러한 변수 중에는 전기 천공 매개 변수 (펄스, 전압, 펄스 지속 시간 등), 유전자 구성 크기 및 주입 된 DNA의 농도...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

근육에서의 전기천공-매개 유전자 전달은 근육 생리학의 변화를 조사하는 쉽고 효율적인 기술이다. 우리는 전기 천공이 근육 수축성을 손상시키지 않는다는 것을 발견했습니다. 생체 내에서 근육으로 유전자 구축물을 전기천공하는 것은 유전자 구축물을 바이러스 벡터로 더 광범위하게 패키징할 필요가 없는 간단하고 효율적인 절차이다.EDL의 위치와 크기가 작기 때문에 EDL을 시각화, 격리 및 주입하는 것은 어렵습니다. 마우스 시체에서 연습하고 인도 잉크와 같은 생물학적 잉크를 주입하면 충분한 주사의 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 문서 인 Brian Hain이 될 것입니다.마우스를 주입하기 전에 발가락 핀치 반사가없는 포셉을 사용하여 마취의 수술 평면을 확인한 다음 마우스를 섭씨 37도의 순환 물 플레이트에 놓여있는 코 콘으로 옮기고 나머지 절차 동안. 마우스를 수핀 위치에 놓으면 작은 머리 깎기를 사용하여 뒷다리에서 머리카락을 제거한 다음 70 % 에탄올과 베타 딘을 번갈아 가며 주사 부위를 소독하십시오. 주사의 경우 아래 다리의 측면 측면에서 피부를 통해 보이는 경골 전방 또는 TA 힘줄을 찾아 TA 근육의 우수한 끝을 표시하십시오.그런 다음 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달 할 때까지 50 마이크로 리터 마이크로 주사기에 장착 된 30 게이지 바늘을 근긴장 접합부보다 한 두 밀리미터 떨어진 얕은 5도 각도로 근육에 삽입하십시오. 주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 눌러 50 마이크로리터의 플라스미드 용액을 근육으로 전달한다. 근육이 부풀어 오른다.타이머를 일분 동안 설정하고 TA 근육에서 다리의 두께를 측정 한 다음 캘리퍼 전극을 측정 된 두께로 설정하십시오. 그런 다음 전기 기공 전압을 밀리미터 당 12.5V로 설정하십시오. 1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 너무 꽉 조이지 않고 하지에 가깝게 배치하여 20밀리초 지속 시간과 200밀리초 간격으로 다섯 개의 구형파 펄스를 전달합니다.근육은 각 맥박으로 경련을 일으켜야합니다. 대조군 플라스미드 벡터를 사용하여 다른 사지와 함께 절차를 반복한다. 완료되면 코 콘에서 마우스를 제거하고 섭씨 37도까지 설정된 가열 패드에서 마우스를 회복시킵니다.복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다. 마우스를 수핀 위치에 두고, 경골 앞쪽 볏을 시각적으로 그리고 부드러운 두근 두근 거림을 통해 찾습니다. 메스를 사용하여 경골 전방 볏의 측면 측면에있는 피부를 통해 얕은 절개를 만들어 무릎보다 다섯 밀리미터 열등하고 TA 근관 접합부보다 두 밀리미터 우수합니다.작은 가위의 도움으로 근막을 뻔뻔스럽게 해부하고 TA 근육을 노출 한 다음 근육을 당겨 경골에서 TA 근육을 부드럽게 분리하여 신전 디지토럼 롱 또는 EDL을 드러냅니다. 작은 곡선 포셉을 사용하여 절차 중에 EDL에서 TA를 깨끗하게 유지하십시오. 바늘이 근육의 우량한 끝에 도달 할 때까지 30 게이지 바늘을 EDL에 세로 방향으로 삽입하고 이전에 입증 된 바와 같이 플라스미드 용액 10 마이크로 리터를 주입하십시오.EDL 근육이 부풀어 오른다. EDL에서 다리의 두께를 측정하고 캘리퍼 전극을 측정 된 두께로 설정하여 앞에서 설명한 것처럼 다섯 개의 구형파 펄스를 전달하십시오. 완료되면 일회용 4-0 비 흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 절개를 닫으십시오.나중에 코 콘에서 마우스를 제거하고 섭씨 37도까지 설정된 가열 패드에서 회복되도록하십시오. 수술 직후와 수술 후 12 ~ 24 시간 후에 적절한 피하 진통제를 투여하십시오. 일단 회복되면 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓으십시오.TA 및 EDL 근육에 pcDNA3-EGFP 플라스미드를 주입하고 전기천공한 후, 근섬유에서 DNA 흡수를 나타내는 GFP 발현을 관찰하였다. 더 낮은 배율로 이미징 될 때, EDL 근육 형질 감염 효율은 녹색 섬유 대 검은 색 섬유의 외관을 통해 시각화 될 수 있습니다. 주입된 EDL과 전기천공된 EDL은 대조군 비주입 또는 전기천공된 근육과 비교하여 100 헤르츠에서 유사한 파타닉 반응을 보였다.주입되고 전기천공된 EDL, 파상근력, 특정 파상근력, 피크 장력까지의 시간, 및 반이완 시간은 손길이 닿지 않은 대조군에 비해 손상되지 않았다. 주사할 근육을 정확하게 식별하고 플라스미드 용액을 효율적으로 전달하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 많은 조직학적 및 생화학적 측정이 이루어질 수 있다.표적 단백질 세포 국소화, 표적 유전자 녹다운, 전사 리포터, 및 조직 염색의 어레이가 실시될 수 있다. 이 기술은 생리학적 및 병리생리학적 조건 동안 근육에서 분자 신호전달의 변화의 광대한 어레이를 확인하기 위해 사용되어 왔다. 유전자 전달 후 근육 수축성에 대한 조사는이 기술을 사용하여 실현 가능합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

연구

생물학

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Prokaryotic 문화 플라스미드 DNA의 유선형 정화

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...