Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Alle eksperimenter med dyr ble utført ved Penn State College of Medicine, godkjent av Penn State University's Institutional Animal Care and Use Committee, og utført i samsvar med de etiske standardene som ble fastsatt i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere endringer. 12 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus ble brukt til denne prosedyren. Alle kirurgiske verktøy ble autoklavert for sterilitet før eksperimentering.
1. TA og EDL injeksjon / elektroporasjon forberedelse</p...

<ol>
	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

In vivo genoverføring i skjelettmuskulatur forsterket av elektroporasjon er et nyttig og relativt enkelt verktøy for modulering av proteinuttrykk i muskel. Vi har vist trinnene som kreves for å oppnå effektiv genoverføring i EDL- og TA-musklene og vist at kontraktilitetsmåling av EDL er levedyktig etter prosedyren. Denne teknikken krever ikke mer kompliserte virale vektorer og tillater sammenligning av transfekterte og ikke-transfekterte muskelfiber tverrsnittsområde i en enkelt muskel. En begrensning i d...

Plasmid DNA-elektroporasjon i skjelettmuskulatur in vivo er et viktig verktøy for å vurdere endringer i skjelettmuskulaturfysiologi og molekylær signalering ved å modulere genuttrykk i en rekke fysiologiske og patofysiologiske forhold 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentell genoverføring til skjelettmuskulatur ble demonstrert så tidlig som i 1990 av Wolff et al., hvor både RNA og DNA ble overført uten elektroporasjon, og luciferaseuttrykk ble opprettholdt i minst 2 måneder10. Den relativt lave transfeksjonseffektiviteten med injeksjon er bare problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerte økt genoverføring med elektroporasjon i 1998 ved å elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruksjon i tibialis fremre (TA) muskel og måle serum IL-5 uttrykk11. Siden den gang har mange studier undersøkt effekten av forskjellige DNA-konsentrasjoner, volumer og elektroporasjonsparametere for å sikre maksimal genoverføringseffektivitet. Mir et al. testet forskjellige elektroporasjonsparametere, inkludert spenning, pulsnummer, pulsvarighet og frekvens, samt DNA-konsentrasjon, og fastslo at større spenning, pulsnummer og DNA-konsentrasjon alle bidro til økt elektroporasjonseffektivitet12. En stor advarsel til høy elektroporasjonsspenning er at selv om det letter økt DNA-opptak i myofibers, forårsaker det også muskelskader, noe som kan forvirre resultatene. Schertzer et al. viste at elektroporasjon ved 200 V forårsaket skade hos rundt 50% av myofibers 3 dager etter elektroporasjon, mens bare 10% av myofibers ble skadet ved 50 V13. Vi har tatt hensyn til variablene som påvirker effektiv DNA-overføring kontra muskelskade og funnet ut at en spenning på 125 V per centimeter kaliperbredde er tilstrekkelig til å oppnå effektiv genoverføring.
Analyse av muskelfiber tverrsnittsområde og hele muskelkontraktilitet etter elektroporasjon er viktige aspekter ved metoden for å måle endringer i muskelstørrelse og funksjon på grunn av genmodulering. Vi og andre har tidligere vist at elektroporasjon av kontrollvektorer alene ikke forårsaker en nedgang i myofiberområdet. Den grønne fluorescerende proteinkonstruksjonen (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator på DNA-transfeksjon i disse studiene13,14. En rekke studier har undersøkt in situ kontraktilitet av TA etter elektroporasjon og funnet varierende resultater. En studie viste at 75 V/cm elektroporasjon forårsaket omtrent 30% reduksjon i tetanisk kraft 3 dager etter elektroporasjon, og med 7 dager etter elektroporasjon var tetanisk kraft tilbake til kontrollnivået, mens 50 V / cm elektroporasjon ikke kompromitterte kraft13,15. En annen studie viste at det var et 30% tap av tetanisk kraft 3 timer etter 180 V / cm elektroporasjon, som gjenopprettet til sham force-nivåene etter 7 dager16.
I den følgende detaljerte prosedyren demonstrerer vi injeksjon og elektroporasjon av en pcDNA3-EGFP plasmid i TA og ekstensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også at denne metoden ikke påvirker EDL hele muskel kontraktilitet. Målet er å demonstrere effektivt plasmidopptak i myofibers uten å forårsake tap av funksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

Forbigående genuttrykksmodulering i murine skjelettmuskulatur ved plasmid elektroporasjon er et nyttig verktøy for å vurdere normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown av målgener gjør det mulig for etterforskere å manipulere individuelle molekylære hendelser og dermed bedre forstå mekanismene som påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. I tillegg tillater elektroporasjon av DNA-plasmider som koder fluorescerende tagger undersøkere å måle endringer i subcellulær lokalisering av proteiner i skjelettmuskulatur in vivo. En viktig funksjonell vurdering av skjelettmuskulaturen inkluderer måling av muskelkontraktilitet. I denne protokollen viser vi at hele muskelkontraktilitetsstudier fortsatt er mulig etter plasmid DNA-injeksjon, elektroporasjon og genuttrykksmodulering. Målet med denne instruksjonsprosedyren er å demonstrere trinnvis metode for DNA-plasmid elektroporasjon i mus skjelettmuskulatur for å lette opptak og uttrykk i myofibers av tibialis fremre og ekstensor digitorum longus muskler, samt å demonstrere at skjelettmuskulatur kontraktilitet ikke er kompromittert av injeksjon og elektroporasjon.

Elektroporasjon for å lette genoverføring i skjelettmuskulatur er en nyttig teknikk som brukes til å evaluere endringer i muskelfysiologi. Vi har demonstrert en detaljert, trinnvis prosedyre for å oppnå effektiv genoverføring i både TA- og EDL-musklene. Forskjeller i transfeksjonseffektivitet oppstår på grunn av en rekke variabler. Blant disse variablene er elektroporasjonsparametere (pulser, spenning, pulsvarighet, etc.), genkonstruksjonsstørrelse og konsentrasjon / volum av DNA injisert. Vi har tidligere vist...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Elektroporasjon av plasmid DNA i skjelettmuskulatur er en levedyktig metode for å modulere genuttrykk uten å gå på kompromiss med muskelkontraktilitet hos mus.

Elektroporasjon av plasmid DNA i mus skjelettmuskulatur

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Elektroporasjon-mediert genoverføring i muskel er en enkel og effektiv teknikk for å undersøke endringer i muskelfysiologi. Vi fant ut at elektroporasjon ikke kompromitterer muskelkontraktilitet. Elektroporasjon av genkonstruksjoner i muskelin vivo er en enkel og effektiv prosedyre som ikke krever mer omfattende emballasje av genkonstruksjoner i virale vektorer.Det er vanskelig å visualisere, isolere og injisere EDL på grunn av sin plassering og lille størrelse. Praktisering på en musekroppe og injeksjon av biologisk blekk som India blekk kan bidra til å gi bevis på tilstrekkelig injeksjon. Å demonstrere prosedyren vil være Brian Hain, en postdoktor fra laboratoriet mitt.Før du injiserer musen, bekreft det kirurgiske planet av anestesi ved hjelp av tang med fravær av tåklemmerefleksen, og overfør deretter musen til en nesekegle som hviler på en sirkulerende vannplate ved 37 grader Celsius for resten av prosedyren. Når musen er plassert i en liggende stilling, fjern håret fra begge bakre lemmer ved hjelp av små hårklippere, og desinfiser deretter injeksjonsområdet med vekslende 70% etanol og betadin. For injeksjonen finne tibialis fremre eller TA sener synlig gjennom huden på siden av underbenet og markere den overlegne enden av TA muskelen.Sett deretter en 30-gauge nål montert på en 50-mikroliter mikrosprøyte i muskelen i en grunn fem graders vinkel en til to millimeter overlegen til det myotendinøse krysset til nålen når den overlegne enden av muskelen. Trykk stempelet mens du sakte trekker nålen langs injeksjonsbanen for å levere 50 mikroliter av plasmidoppløsningen inn i muskelen. Muskelen skal svulme.Still inn timeren i ett minutt og mål tykkelsen på benet ved TA-muskelen, og sett deretter kaliperelektrodene til den målte tykkelsen. Sett deretter elektroporatorspenningen til 12,5 volt per millimeter. Etter ett minutt plasserer du kaliperelektrodene tett rundt underekstremiteten uten å være altfor tette for å levere fem firkantede bølgepulser med 20-millisekunders varighet og intervaller på 200 millisekunder.Muskelen skal rykke med hver puls. Gjenta prosedyren med den andre lemmen ved hjelp av kontrollplasmidvektoren. Når du er ferdig, fjern musen fra nesekjeglen og la musen gjenopprette på en varmepute satt til 37 grader Celsius.Når den er gjenopprettet, returner musen til buret. Med musen i en liggende stilling, finn tibiabenet fremre kam visuelt og gjennom mild hjertebank. Bruk en skalpell for å gjøre et grunt snitt gjennom huden på sidesiden av tibia fremre kam fem millimeter dårligere enn kneet til to millimeter overlegen TA myotendinøst kryss.Ved hjelp av liten saks dissekerer fasciaen direkte, utsetter TA-muskelen, og skiller deretter TA-muskelen fra tibia forsiktig ved å trekke muskelen for å avsløre ekstensor digitorum longus eller EDL. Hold TA klar fra EDL under prosedyren ved hjelp av små buede tang. Sett 30-gauge nålen inn i EDL-langsgående til nålen når den overlegne enden av muskelen og injiser 10 mikroliter av plasmidoppløsningen som vist før.EDL-muskelen skal svulme. Mål tykkelsen på benet ved EDL og sett kaliperelektrodene til den målte tykkelsen for å levere fem kvadratiske bølgepulser som forklart tidligere. Når du er ferdig, lukk snittet ved hjelp av engangs 4-0 ikke-absorberbare nylon suturer.Fjern senere musen fra nesekjeglen og la den gjenopprette på en varmepute satt til 37 grader Celsius. Administrer et passende subkutant smertestillende umiddelbart etter operasjonen og 12 til 24 timer etter operasjonen. Når den er gjenopprettet, returner musen til hjemmeburet.Etter injeksjon og elektroporasjon av pcDNA3-EGFP plasmid i TA- og EDL-musklene ble GFP-uttrykket observert som indikerer DNA-opptak i muskelfibrene. Når det er avbildet med en lavere forstørrelse, kan EDL muskeltransfeksjonseffektivitet visualiseres gjennom utseendet av grønne fibre kontra svarte fibre. De injiserte og elektroporerte EDLene hadde lignende tetaniske responser ved 100 Hertz sammenlignet med kontrollen ikke-injiserte eller elektroporerte muskler.Den injiserte og elektroporerte EDL, den tetaniske muskelkraften, spesifikk tetanisk muskelkraft, tid til toppspenning og halv avslapningstid ble ikke kompromittert sammenlignet med den uberørte kontrollen. Det er viktig å nøyaktig identifisere muskelen som skal injiseres og effektivt levere plasmidløsningen. En rekke histologiske og biokjemiske målinger kan gjøres ved hjelp av denne protokollen.Målprotein cellulær lokalisering, målgen knockdown, transkripsjonelle reportere, og en rekke vev farging kan utføres. Denne teknikken har blitt brukt til å identifisere et stort utvalg av endringer i molekylær signalering i muskel under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Undersøkelsen av muskelkontraktiliteten etter genoverføring er mulig ved hjelp av denne teknikken.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Deteksjon og analyse av DNA Skade i Mouse Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Bruke TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Romanen leveringsmåten plasmider DNA til musen blæren Urothelium av Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...