Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
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Todos os experimentos com animais foram realizados no Penn State College of Medicine, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Penn State University, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 semanas de idade para este procedimento. Todas as ferramentas cirúrgicas foram autoclavadas para esterilidade antes da experimentação.
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	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

A transferência genética in vivo no músculo esquelético reforçada pela eletroporação é uma ferramenta útil e relativamente simples para modular a expressão proteica no músculo. Mostramos as etapas necessárias para alcançar uma transferência genética eficiente nos músculos EDL e TA e demonstramos que a medição da contratilidade do EDL é viável após o procedimento. Esta técnica não requer vetores virais mais complicados e permite a comparação de fibras transfeinadas e não transfectadas tr...

A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi demonstrada já em 1990 por Wolff et al., onde tanto o RNA quanto o DNA foram transferidos com sucesso sem eletroporação, e a expressão da luciferase foi mantida por pelo menos 2 mesese 10. A eficiência relativamente baixa de transfecção com injeção é apenas problemática, e Aihara e Miyazaki demonstraram aumento da transferência genética com eletroporação em 1998, eletroporando uma construção pCAGGS-IL-5 no músculo tibialis anterior (TA) e medindo a expressão sérica IL-511. Desde então, muitos estudos têm investigado a eficácia de diferentes concentrações de DNA, volumes e parâmetros de eletroporação para garantir a eficiência máxima da transferência genética. Mir et al. testaram diferentes parâmetros de eletroporação, incluindo tensão, número de pulso, duração do pulso e frequência, bem como concentração de DNA, e determinaram que maior tensão, número de pulso e concentração de DNA contribuíram para o aumento da eficiência da eletroporação12. Uma grande ressalva à alta tensão eletroporação é que, embora facilite o aumento da absorção de DNA em miofibers, também causa danos musculares, o que pode confundir resultados. Schertzer et al. mostraram que a eletroporação a 200 V causou danos em cerca de 50% dos myofibers 3 dias após a eletroporação, enquanto apenas 10% dos myofibers foram danificados em 50 V13. Levamos em consideração as variáveis que afetam a transferência eficiente de DNA versus dano muscular e descobrimos que uma tensão de 125 V por centímetro de largura de pinça é suficiente para realizar uma transferência genética eficaz.
A análise da área transversal da fibra muscular e da contralidade muscular inteira após a eletroporação são aspectos importantes do método para medir mudanças no tamanho e função muscular devido à modulação genética. Nós e outros já demonstramos anteriormente que a eletroporação de vetores de controle por si só não causa uma diminuição na área de miofibra. A construção da proteína fluorescente verde (EGFP) foi um indicador fluorescente útil da transfecção de DNA nestes estudos13,14. Vários estudos investigaram a contração in situ do TA após a eletroporação e encontraram resultados variados. Um estudo mostrou que a eletroporação de 75 V/cm causou uma redução de cerca de 30% na força tetanica 3 dias após a eletroporação, e em 7 dias após a eletroporação, a força tetanica voltou ao nível de controle, enquanto a eletroporação de 50 V/cm não comprometeu a força13,15. Outro estudo mostrou que houve uma perda de 30% da força tetanica 3h após a eletroporação de 180 V/cm, que se recuperou para os níveis de força falsa após 7 dias16.
No procedimento detalhado a seguir, demonstramos injeção e eletroporação de um plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. Também demonstramos que este método não afeta a contratude muscular total edl. O objetivo é demonstrar uma absorção plasmida eficiente em myofibers sem causar perda de função.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

A modulação da expressão genética transitória no músculo esquelético murino por eletroporação plasmida é uma ferramenta útil para avaliar a fisiologia normal e patológica. A superexpressão ou derrubada de genes-alvo permite aos pesquisadores manipular eventos moleculares individuais e, assim, entender melhor os mecanismos que afetam a massa muscular, o metabolismo muscular e a contralidade. Além disso, a eletroporação de plasmídeos de DNA que codificam etiquetas fluorescentes permite aos pesquisadores medir mudanças na localização subcelular de proteínas no músculo esquelético in vivo. Uma avaliação funcional chave do músculo esquelético inclui a medição da contralução muscular. Neste protocolo, demonstramos que estudos de contratude muscular ainda são possíveis após injeção de DNA plasmid, eletroporação e modulação da expressão genética. O objetivo deste procedimento instrucional é demonstrar o método passo-a-passo da eletroporação plasmóide de DNA no músculo esquelético do camundongo para facilitar a absorção e a expressão nos miofibers dos músculos tibialis anterior e extensor digitorum longus, bem como demonstrar que a contratilação muscular esquelética não está comprometida pela injeção e eletroporação.

A eletroporação para facilitar a transferência genética no músculo esquelético é uma técnica útil usada para avaliar alterações na fisiologia muscular. Demonstramos um procedimento detalhado passo a passo para realizar uma transferência genética eficiente nos músculos TA e EDL. As diferenças na eficiência da transfecção ocorrem devido a uma série de variáveis. Entre essas variáveis estão parâmetros de eletroporação (pulsos, tensão, duração do pulso, etc.), tamanho da construção genética e c...

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Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

A transferência genética mediada por eletroporação no músculo é uma técnica fácil e eficiente para investigar mudanças na fisiologia muscular. Descobrimos que a eletroporação não compromete a contratude muscular. A eletroporação de construções genéticas em in vivo muscular é um procedimento simples e eficiente que não requer embalagens mais extensas de construções genéticas em vetores virais.É difícil visualizar, isolar e injetar o EDL devido à sua localização e tamanho pequeno. Praticar em uma carcaça de rato e injeção de tinta biológica, como a tinta da Índia, pode ajudar a fornecer evidências de injeção suficiente. Demonstrando o procedimento será Brian Hain, um pós-doutor do meu laboratório.Antes de injetar o rato, confirme o plano cirúrgico da anestesia usando fórceps com a ausência do reflexo do dedo do pé, em seguida, transfira o rato para um cone de nariz descansando em uma placa de água circulante a 37 graus Celsius para o resto do procedimento. Uma vez que o rato é colocado em uma posição supina, remova o cabelo de ambos os membros traseiros usando pequenos cortadores de cabelo, em seguida, higienize a área de injeção com 70% de etanol e betadina alternadas. Para a injeção, localize o tendão tibialis anterior ou TA visível através da pele no lado lateral da perna inferior e marque a extremidade superior do músculo TA.Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 montada em uma micro seringa de 50 microliter no músculo em um ângulo raso de cinco graus de um a dois milímetros superior à junção miotendinous até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo. Deprimir o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho de injeção para entregar 50 microliters da solução plasmida no músculo. O músculo deve inchar.Defina o temporizador por um minuto e meça a espessura da perna no músculo TA e, em seguida, coloque os eletrodos de pinça na espessura medida. Em seguida, defina a tensão eletroporante para 12,5 volts por milímetro. Após um minuto, coloque os eletrodos de pinça de perto ao redor do membro inferior sem ser excessivamente apertado para entregar cinco pulsos de onda quadrada com duração de 20 milissegundos e intervalos de 200 milissegundos.O músculo deve se contrair a cada pulso. Repita o procedimento com o outro membro usando o vetor plasmídeo de controle. Quando feito, remova o mouse do cone do nariz e deixe que o mouse se recupere em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius.Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola. Com o rato em uma posição supina, localize a crista anterior do osso da tíbia visualmente e através da gentil palpitação. Use um bisturi para fazer uma incisão rasa através da pele no lado lateral da crista anterior da tíbia cinco milímetros inferior ao joelho a dois milímetros superior à junção miotendinous TA.Com a ajuda de uma tesoura pequena dissecar sem rodeios a fáscia, expondo o músculo TA, e então separar o músculo TA da tíbia suavemente puxando o músculo para revelar o extensor digitorum longus ou EDL. Mantenha o TA afastado do EDL durante o procedimento usando pequenas fórceps curvas. Insira a agulha de calibre 30 no EDL longitudinalmente até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo e injete 10 microliters da solução plasmida como demonstrado antes.O músculo EDL deve inchar. Meça a espessura da perna no EDL e coloque os eletrodos de pinça na espessura medida para entregar cinco pulsos de onda quadrada, como explicado anteriormente. Quando feito, feche a incisão usando suturas descartáveis de nylon 4-0 não absorvíveis.Mais tarde, remova o mouse do cone do nariz e deixe-o se recuperar em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius. Administre um analgésico subcutâneo apropriado imediatamente após a cirurgia e de 12 a 24 horas após a cirurgia. Uma vez recuperado, devolva o rato para a gaiola.Após a injeção e eletroporação do plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e EDL, observou-se a expressão GFP indicando a absorção de DNA nas fibras musculares. Quando visualizada em uma ampliação mais baixa, a eficiência de transfecção muscular EDL poderia ser visualizada através do aparecimento de fibras verdes versus fibras pretas. Os EDLs injetados e eletroporados tiveram respostas tetanicas semelhantes em 100 Hertz em comparação com o controle de músculos não injetados ou eletroporados.O EDL injetado e eletroporado, a força muscular tetanica, força muscular tetanica específica, tempo para pico de tensão, e metade do tempo de relaxamento não foram comprometidos em comparação com o controle intocado. É importante identificar com precisão o músculo a ser injetado e entregar eficientemente a solução plasmida. Uma série de medições histológicas e bioquímicas podem ser feitas usando este protocolo.Localização celular de proteína alvo, derrubada de genes alvo, repórteres transcricionais e uma série de manchas de tecido podem ser conduzidas. Esta técnica tem sido usada para identificar uma vasta gama de alterações na sinalização molecular no músculo durante condições fisiológicas e fisiodicos. A investigação da contralidade muscular após a transferência genética é viável usando essa técnica.

Research

JoVE Journal

Biology

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