Name: electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Alla djurförsök utfördes vid Penn State College of Medicine, godkända av Penn State Universitys institutionella djurvårds- och användningskommitté, och utfördes i enlighet med de etiska normer som fastställdes i Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar. 12 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss användes för denna procedur. Alla kirurgiska verktyg autoklaverades för sterilitet före experiment.
1. Beredning av TA- och EDL-injektion/elektroporering<...

<ol>
	<li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats.">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li><li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse.">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li><li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp27+inhibits+IKK&#946;-induced+NF-&#954;B+activity+and+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp27 inhibits IKK&#946;-induced NF-&#954;B activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li><li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication.">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li><li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle.">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li><li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy.">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy.">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li><li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle:+studies+on+isolated+fibers.">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li><li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation.">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li><li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo.">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li><li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo.">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li><li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function.">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice.">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li><li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation.">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy.">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li><li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice.">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li><li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia.">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li><li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice.">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li><li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice.">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732 (2015).</li><li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70.">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li><li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo.">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li><li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle.">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li><li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficacy,+longevity,+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles.">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li></ol>

In vivo genöverföring i skelettmuskulatur förstärkt genom elektroporering är ett användbart och relativt enkelt verktyg för att modulera proteinuttryck i muskler. Vi har visat de steg som krävs för att uppnå effektiv genöverföring i EDL- och TA-musklerna och visat att kontraktilitetsmätning av EDL är livskraftig efter proceduren. Denna teknik kräver inte mer komplicerade virala vektorer och möjliggör jämförelse av transfekterad och icke-transfekt muskelfibertvärsnittsarea i en enda muskel. En...

Plasmid-DNA-elektroporering i skelettmuskulaturen in vivo är ett viktigt verktyg för att bedöma förändringar i skelettmuskelfysiologi och molekylär signalering genom att modulera genuttryck i en mängd olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentell genöverföring till skelettmuskulatur demonstrerades redan 1990 av Wolff et al., där både RNA och DNA framgångsrikt överfördes utan elektroporering, och luciferasuttryck bibehölls i minst 2 månader10. Den relativt låga transfektionseffektiviteten med endast injektion är problematisk, och Aihara och Miyazaki visade ökad genöverföring med elektroporering 1998 genom att elektroporera en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis främre (TA) muskel och mäta serum IL-5-uttryck11. Sedan dess har många studier undersökt effekten av olika DNA-koncentrationer, volymer och elektroporeringsparametrar för att säkerställa maximal genöverföringseffektivitet. testade olika elektroporeringsparametrar, inklusive spänning, pulsnummer, pulsvaraktighet och frekvens, samt DNA-koncentration, och bestämde att större spänning, pulsnummer och DNA-koncentration alla bidrog till ökad elektroporeringseffektivitet12. En viktig varning för hög elektroporeringsspänning är att även om det underlättar ökat DNA-upptag i myofibrer, orsakar det också muskelskador, vilket kan förvirra resultaten. visade att elektroporering vid 200 V orsakade skador i cirka 50% av myofibrerna 3 dagar efter elektroporering, medan endast 10% av myofibrerna skadades vid 50 V13. Vi har tagit hänsyn till de variabler som påverkar effektiv DNA-överföring kontra muskelskada och funnit att en spänning på 125 V per centimeter bromsokbredd är tillräcklig för att uppnå effektiv genöverföring.
Analys av muskelfibertvärsnittsarea och helmuskelkontraktilitet efter elektroporering är viktiga aspekter av metoden för att mäta förändringar i muskelstorlek och funktion på grund av genmodulering. Vi och andra har tidigare visat att elektroporering av enbart kontrollvektorer inte orsakar en minskning av myofiberområdet. Konstruktionen av grönt fluorescerande protein (EGFP) var en användbar fluorescerande indikator för DNA-transfektion i dessa studier13,14. Ett antal studier har undersökt in situ kontraktilitet av TA efter elektroporering och funnit varierande resultat. En studie visade att 75 V / cm elektroporering orsakade cirka 30% minskning av tetanisk kraft 3 dagar efter elektroporering, och med 7 dagar efter elektroporering var tetanisk kraft tillbaka till kontrollnivån, medan 50 V / cm elektroporering inte äventyrade kraften13,15. En annan studie visade att det fanns en 30% förlust av tetanisk kraft 3 h efter 180 V / cm elektroporering, som återhämtade sig till skenkraftnivåerna efter 7 dagar16.
I följande detaljerade procedur demonstrerar vi injektion och elektroporering av en pcDNA3-EGFP-plasmid i TA- och extensor digitorum longus (EDL) -musklerna hos möss. Vi visar också att denna metod inte påverkar EDL-helmuskelkontraktiliteten. Syftet är att påvisa effektivt plasmidupptag i myofibrer utan att orsaka funktionsförlust.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture (non-absorbable)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>Suture to close skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BLl/6NHsd mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>044</td>
			<td>12 week-old female mice used for experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper Electrode</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0102</td>
			<td>1.0cm x 1.0cm stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>605A</td>
			<td>Software used for muscle contractility measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Narrow Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Scissors for blunt dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>407A</td>
			<td>To measure force from EDL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Masquito Hemastats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13010-12</td>
			<td>Hemastats for surturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 mammalian expression vector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V79020</td>
			<td>Control Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td>Plasmid for GFP expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td>Forceps for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades stainless steel no. 10</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>37 1210</td>
			<td>Scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. media</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Freezing media for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin- Texas Red</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>W21405</td>
			<td>Membrane staining for muscle cross section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of plasmid dna into mouse skeletal muscle

Övergående genuttrycksmodulering i murin skelettmuskel genom plasmidelektroporering är ett användbart verktyg för att bedöma normal och patologisk fysiologi. Överuttryck eller knockdown av målgener gör det möjligt för utredare att manipulera enskilda molekylära händelser och därmed bättre förstå de mekanismer som påverkar muskelmassa, muskelmetabolism och kontraktilitet. Dessutom tillåter elektroporering av DNA-plasmider som kodar fluorescerande taggar utredare att mäta förändringar i subcellulär lokalisering av proteiner i skelettmuskulaturen in vivo. En viktig funktionell bedömning av skelettmuskulaturen inkluderar mätning av muskelkontraktilitet. I detta protokoll visar vi att hela muskelkontraktilitetsstudier fortfarande är möjliga efter plasmid-DNA-injektion, elektroporering och genuttrycksmodulering. Målet med denna instruktionsprocedur är att demonstrera steg-för-steg-metoden för DNA-plasmidelektroporering i musskelettmuskulatur för att underlätta upptag och uttryck i myofibrerna i tibialis främre och extensor digitorum longus muskler, samt att visa att skelettmuskelkontraktilitet inte äventyras genom injektion och elektroporation.

Elektroporering för att underlätta genöverföring i skelettmuskulaturen är en användbar teknik som används för att utvärdera förändringar i muskelfysiologi. Vi har demonstrerat en detaljerad, steg-för-steg-procedur för att åstadkomma effektiv genöverföring i både TA- och EDL-musklerna. Skillnader i transfektionseffektivitet uppstår på grund av ett antal variabler. Bland dessa variabler finns elektroporeringsparametrar (pulser, spänning, pulsvaraktighet etc.), genkonstruktionsstorlek och koncentration /...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Elektroporering av plasmid-DNA i skelettmuskulaturen är en livskraftig metod för att modulera genuttryck utan att kompromissa med muskelkontraktiliteten hos möss.

Elektroporering av plasmid-DNA i musskelettmuskel

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Elektroporationsmedierad genöverföring i muskler är en enkel och effektiv teknik för att undersöka förändringar i muskelfysiologi. Vi fann att elektroporering inte äventyrar muskelkontraktiliteten. Elektroporering av genkonstruktioner till muskelin vivo är ett enkelt och effektivt förfarande som inte kräver mer omfattande förpackning av genkonstruktioner till virala vektorer.Det är svårt att visualisera, isolera och injicera EDL på grund av dess läge och lilla storlek. Att öva på en muskropp och injektion av biologiskt bläck som Indien-bläck kan hjälpa till att ge bevis på tillräcklig injektion. Visar proceduren kommer att vara Brian Hain, en post doc från mitt laboratorium.Innan du injicerar musen, bekräfta det kirurgiska anestesiplanet med pincett med frånvaro av tånypreflexen och överför sedan musen till en näskotte som vilar på en cirkulerande vattenplatta vid 37 grader Celsius under resten av proceduren. När musen har placerats i ryggläge, ta bort hår från båda bakbenen med små hårklippare och sanera sedan injektionsområdet med alternerande 70% etanol och betadin. För injektionen lokalisera tibialis främre eller TA-senan som är synlig genom huden på sidosidan av underbenet och markera den överlägsna änden av TA-muskeln.Sätt sedan in en 30-gauge nål monterad på en 50-mikroliter mikrospruta i muskeln i en grund fem graders vinkel en till två millimeter överlägsen den myotendinösa korsningen tills nålen når den överlägsna änden av muskeln. Tryck ner kolven medan du långsamt drar tillbaka nålen längs injektionsvägen för att leverera 50 mikroliter av plasmidlösningen till muskeln. Muskeln ska svälla.Ställ in timern i en minut och mät benets tjocklek vid TA-muskeln och ställ sedan in bromsokelektroderna på den uppmätta tjockleken. Ställ sedan in elektroindunatorspänningen till 12,5 volt per millimeter. Efter en minut placerar du bromsokselektroderna nära runt underbenet utan att vara alltför täta för att leverera fem fyrkantsvågspulser med 20 millisekunders varaktighet och 200 millisekunders intervall.Muskeln ska rycka med varje puls. Upprepa proceduren med den andra lemmen med hjälp av kontrollplasmidvektorn. När du är klar tar du bort musen från noskonen och låter musen återhämta sig på en värmedyna inställd på 37 grader Celsius.När du har återhämtat dig, sätt tillbaka musen i buret. Med musen i ryggläge, lokalisera tibiabenets främre vapen visuellt och genom mild hjärtklappning. Använd en skalpell för att göra ett grunt snitt genom huden på sidosidan av skenbenets främre krön fem millimeter sämre än knäet till två millimeter överlägsen ta-myotendinös korsning.Med hjälp av en liten sax dissekerar du fascian, exponerar TA-muskeln och separerar sedan TA-muskeln från skenbenet försiktigt genom att dra i muskeln för att avslöja extensor digitorum longus eller EDL. Håll TA fri från EDL under proceduren med små böjda pincett. Sätt in 30-gaugenålen i EDL i längdriktningen tills nålen når den överlägsna änden av muskeln och injicera 10 mikroliter av plasmidlösningen som visats tidigare.EDL-muskeln ska svälla. Mät benets tjocklek vid EDL och ställ in bromsokelektroderna på den uppmätta tjockleken för att leverera fem fyrkantsvågspulser som förklarats tidigare. När du är klar stänger du snittet med engångs 4-0 icke-absorberbara nylonsuturer.Ta senare bort musen från noskonen och låt den återhämta sig på en värmedyna inställd på 37 grader Celsius. Administrera ett lämpligt subkutant smärtstillande medel omedelbart efter operationen och 12 till 24 timmar efter operationen. När du har återhämtat dig, returnera musen till hemburet.Efter injektion och elektroporering av pcDNA3-EGFP-plasmiden i TA- och EDL-musklerna observerades GFP-uttrycket som indikerar DNA-upptag i muskelfibrerna. När den avbildas med en lägre förstoring kan EDL-muskeltransfektionseffektiviteten visualiseras genom utseendet på gröna fibrer kontra svarta fibrer. De injicerade och elektroporerade EDL: erna hade liknande tetaniska svar vid 100 Hertz jämfört med de icke-injicerade eller elektroporerade musklerna.Den injicerade och elektroporerade EDL, den tetaniska muskelkraften, specifik tetanisk muskelkraft, tid till toppspänning och halv avslappningstid äventyrades inte jämfört med den orörda kontrollen. Det är viktigt att noggrant identifiera muskeln som ska injiceras och att effektivt leverera plasmidlösningen. Ett antal histologiska och biokemiska mätningar kan göras med hjälp av detta protokoll.Målproteincellulär lokalisering, målgen knockdown, transkriptionella reportrar och en rad vävnadsfärgningar kan utföras. Denna teknik har använts för att identifiera ett stort antal förändringar i molekylär signalering i muskler under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Undersökningen av muskelkontraktiliteten efter genöverföring är möjlig med hjälp av denna teknik.

Research

JoVE Journal

Biology

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Omvandling av Plasmid DNA i E. coli med metoden Heat Shock

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Strömlinjeformad Rening av Plasmid DNA från Prokaryota kulturer

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur<em&gt; In situ</em&gt; Använda TUNEL metoden

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Romanen leveranssätt Plasmid DNA till mus urinblåsan urotel av elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...