Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

نحن نقر بالدعم المالي المقدم من قسم الهندسة الحيوية في إمبريال كوليدج لندن و The Leverhulme Trust (مرجع منحة البحث: RPG-2020-352).

ملاحظة: يرد ملخص للإجراءات المبينة في هذا البروتوكول بصورة مرئية في الشكل 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> الشكل 2: تمثيل تخطيطي للمنهجية المقدمة يتألف من خمسة أقسام رئيسية مفصلة في هذا البروتوكول.<...

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لدراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية باستخدام الموائع الدقيقة للقناة. يهدف المؤلفون إلى إظهار تنوع هذه الأجهزة وتشجيع التكيف لتناسب اهتمامات الباحث. باستخدام أجهزة BFI و FFI النموذجية ، يمكن دراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية بمزيد من التفصيل مما كان يمكن الوصول...

التربة هي بيئة متنوعة بشكل استثنائي تحتوي على وفرة من الكائنات الحية الدقيقة التي لها دور أساسي في دورات الكربون والفوسفور 1,2. الفطريات الخيطية هي عنصر رئيسي في العديد من النظم الإيكولوجية كمتحللة للمواد العضوية وغير العضوية ويمكن أن تعزز تغذية النباتات من خلال تشكيل علاقات تكافلية 3,4. داخل التربة ، تتفاعل الفطريات ديناميكيا مع العديد من الميكروبات مثل الفطريات الأخرى5 والبكتيريا6 والفيروسات7 والديدان الخيطية8. هذه التفاعلات لها عواقب وخيمة على صحة التربة والنبات. ومع ذلك، وبسبب الافتقار إلى النظم التجريبية المناسبة القادرة على تصوير الكائنات الحية الدقيقة المتفاعلة بدقة عالية، لا يزال العديد منها غير محدد.
وللتحقيقات المتعلقة بالتفاعلات البكتيرية الفطرية والتفاعلات الفطرية والفطرية تطبيقات قيمة في طائفة من المجالات، بما في ذلك مضادات الميكروبات في الطب وعوامل المكافحة البيولوجية في الزراعة. على سبيل المثال ، ينتج الفطر Coprinopsis cinerea الببتيد copsin، الذي ثبت أنه يظهر نشاطا مضادا للبكتيريا ضد العامل الممرض البشري Listeria monocytogenes9. وبالمثل ، يستخدم المركب المشتق من الفطريات ، griseofulvin ، على نطاق واسع كعلاج للعدوى الفطرية البشرية ، بالإضافة إلى أنه قادر على تثبيط نمو الفطريات المسببة للأمراض النباتية Alternaria solani10,11. كما ثبت أن العديد من سلالات بكتيريا Bacillus subtilis التي تعيش في التربة هي عوامل فعالة للمكافحة الحيوية للنبات الفطري الممرض Rhizoctonia solani12,13. ومع ذلك، ونظرا للقيود المرتبطة بالمنهجيات التقليدية، فإن مؤسسات التمويل الدولية ومؤسسات التمويل الأجنبي غير مفهومة بشكل جيد على مستوى الخلايا المفردة.
عادة ما تستكشف الدراسات التقليدية BFIs و FFIs على النطاق الكلي باستخدام ألواح أجار مع نوعين أو أكثر في المواجهة. يتم تقييم تفاعلها عن طريق قياس معدلات النمو وإنتاج الأيض للأنواع المواجهة14،15،16 ؛ ومع ذلك ، يتم حل هذه المنهجية فقط على مستوى المستعمرة. لدراسة التفاعلات على المستوى الخلوي ، يمكن زراعة اللقاحات البكتيرية والفطرية على شرائح المجهر الزجاجية المغلفة بالأجار والتي يتم تصويرها بعد ذلك تحت المجهر17. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب اتباع hypha واحد باستخدام شرائح المجهر بسبب عدم وجود حبس ، مما يعني أنه من الصعب الحصول على صور الفاصل الزمني. علاوة على ذلك ، فإن فرصة حصر الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مكانيا داخل مناطق محددة من الميسيليوم الفطري أو إنشاء بيئات كيميائية محددة يمكن إزعاجها ، على سبيل المثال ، غير ممكنة في مثل هذه الإعدادات. تضيف طبيعة "الصندوق الأسود" للتربة أيضا إلى تعقيد دراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية على مستوى الخلايا المفردة18. من خلال مراقبة الأنواع المتفاعلة بعيدا عن التنوع المذهل لميكروبيوم التربة ، يمكن تقييم الطريقة الدقيقة التي يتفاعل بها الأعضاء الأفراد. وبالتالي ، هناك حاجة مستمرة إلى منصات متعددة الاستخدامات تمكن من التصوير عالي الدقة وخلية واحدة ل BFIs و FFIs.
توفر تقنيات الموائع الدقيقة ، ما يسمى بأنظمة المختبر على رقاقة ، منصة مثالية لدراسة BFIs و FFIs على مستوى الخلايا المفردة. تم اعتماد مجال الموائع الدقيقة ، الناشئة عن التقنيات المطورة للتحليل الكيميائي والإلكترونيات الدقيقة ، من قبل العلوم البيولوجية19. تنظم تقنيات الموائع الدقيقة كميات صغيرة من السوائل داخل شبكة مخصصة من القنوات المصغرة ، لها بعد واحد على الأقل على مقياس الميكرومتر ، ويتوسع استخدامها في الأبحاث البيولوجية20. على وجه الخصوص ، تم تطوير أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة نمو الفطريات الخيطية21،22،23،24،25،26،27،28،29،30. إحدى فوائد استخدام هذه التكنولوجيا هي أن حبس hyphae وتوزيع العناصر الغذائية داخل القنوات الدقيقة يشبه إلى حد كبير بنية بيئة التربة أكثر من طرق الأجار التقليدية31. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام منصات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات بين العدلات البشرية ومسببات الأمراض الفطرية32 ، والبكتيريا وجذور النباتات 33 ، وكذلك الفطريات والديدان الخيطية34,35.
واحدة من المزايا العديدة لاستخدام الموائع الدقيقة لدراسة التفاعلات الميكروبية تشمل التحكم المحدد في بيئة القنوات الدقيقة. على سبيل المثال ، يمكن استغلال أنظمة التدفق الرقائقي لتوليد تدرجات تركيز محددة ، وهو أمر مفيد بشكل خاص عند فحص التاكسي الكيميائي البكتيري36. ميزة أخرى هي أن الطبيعة الشفافة ل poly (dimethylsiloxane) (PDMS) ، وهو بوليمر مطاطي غير مكلف ومتوافق حيويا يستخدم عادة في تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة ، يسهل التصوير عالي الدقة للخلايا المفردة باستخدام المجهر الساطع والفلوري37. وبالمثل ، فإن حبس الميكروبات داخل القنوات الدقيقة يعني أنه يمكن إجراء تجارب الفاصل الزمني التي تتعقب الخلايا المفردة ، مما يسمح بتسجيل الاستجابات الخلوية الفردية وتحديدها كميا37. وأخيرا، بما أنه يمكن تصميم أجهزة الموائع الدقيقة لتكون سهلة الاستخدام، يمكن استخدامها بسهولة من قبل غير الخبراء38.
ومن المهم تعزيز المعرفة بالتفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في التربة لتحسين ممارسات الإدارة المستدامة للنظم الإيكولوجية التي تحافظ على التنوع البيولوجي وللتخفيف من أثر تغير المناخ على البيئات الأرضية39. وبالتالي ، فإن تطوير أدوات جديدة للموائع الدقيقة أمر أساسي لتوسيع فهم الفطريات وتفاعلاتها على المستوى الخلوي. وسيركز البروتوكول هنا على جهازين من أجهزة الموائع الدقيقة المنتجة لدراسة BFIs40 و FFIs41 كما هو موضح في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> الشكل 1: التمثيل البصري والتخطيطي لأجهزة التفاعل البكتيري الفطري (BFI) والتفاعل الفطري الفطري (FFI). (أ) صورة لجهاز BFI. يتم وضع قابس mycelial عند مدخل أحد طرفي القنوات الدقيقة للسماح بنمو hyphal في الجهاز. المدخل البكتيري في الطرف المعاكس. شريط المقياس = 5 مم (B) نظرة عامة تخطيطية على جهاز BFI ، تصور موضع المداخل البكتيرية واتجاه نمو الواصلة من خلال القنوات الدقيقة التفاعلية. يبلغ عمق القنوات 10 ميكرومتر وعرضها 100 ميكرومتر وطولها 7 مم ، مع 28 قناة مراقبة في المجموع. (ج) فحص المواجهة على صفيحة أجار بين Coprinopsis cinerea و Bacillus subtilis NCIB 3610 ، شريط المقياس = 20 مم (يسار). صور مجهرية تظهر التفاعل بين C. cinerea و B. subtilis NCIB 3610 داخل القناة الدقيقة (الوسطى واليمنى) ، أي التعلق القطبي للبكتيريا ب hyphae الفطرية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (وسط) و 10 ميكرومتر (يمين). (د) صورة لجهاز FFI مرتبط بطبق بتري ذو قاع زجاجي ، ملقح مزدوج بسدادات mycelial. شريط المقياس = 1 سم (E) نظرة عامة تخطيطية لجهاز FFI. يتم إدخال اثنين من سدادات التطعيم الفطرية في المداخل في أي من طرفي الجهاز ، مما يسمح بالاستكشاف الواصلي للقنوات الدقيقة. ترتبط قنوات التحكم بمدخل فطري واحد فقط ولها قناة مسدودة ، مما يمنع التفاعلات بين فطريات الاختبار. تربط قنوات التفاعل كلا من المداخل الفطرية وتسمح بالتفاعلات الواصلة بين مواضيع الاختبار داخل القناة الدقيقة. تتكون كل قناة تفاعل من 18 قسما على شكل ماس ، يبلغ طولها الإجمالي 8.8 مم (490 × 430 ميكرومتر لكل ماسة) ، وعمقها 10 ميكرومتر ، ولها منطقة ربط بين كل ماسة تبلغ 20 ميكرومتر. يتم تكرار أنواع القنوات ، أشرطة المقياس = 1 مم. (F) منطقة التفاعل بين جبهتين واصليتين تقتربان ، تنمو من طرفي نقيض من قناة التفاعل المترابطة. صورة مجهرية لتباين الطور ، شريط مقياس = 250 ميكرومتر. تم تعديل اللوحات الواردة في هذا الشكل من Stanley et al., 2014 (A-C)40 and Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

الفطريات الخيطية هي سكان ناجحون في التربة وتلعب دورا رئيسيا في النظم الإيكولوجية للتربة ، مثل تحلل المواد العضوية وغير العضوية ، وكذلك تنظيم مستويات المغذيات. هناك يجدون أيضا العديد من الفرص للتفاعل مع مجموعة متنوعة من الميكروبات الأخرى مثل البكتيريا أو الفطريات الأخرى. ومع ذلك ، فإن دراسة التفاعلات الفطرية على المستوى الخلوي يمكن أن تكون صعبة بسبب طبيعة التربة الشبيهة بالصندوق الأسود. ويجري تطوير أدوات جديدة للموائع الدقيقة لدراسة التفاعلات الفطرية؛ يتم تسليط الضوء على منصتين مصممتين لدراسة التفاعلات البكتيرية الفطرية والفطرية والفطرية. داخل هذه القنوات الدقيقة ، يمكن مراقبة التفاعلات الفطرية الميكروبية في بيئات فيزيائية كيميائية خاضعة للرقابة بدقة زمنية ومكانية أعلى مما كان ممكنا في السابق. وقد أسفر تطبيق هذه الأدوات عن العديد من الرؤى البيولوجية الجديدة، مثل ملاحظة الارتباط القطبي البكتيري بالهيفاي أو الكشف عن العداوات الفطرية الفطرية غير المميزة. ومن السمات الرئيسية لهذه المنهجيات سهولة استخدام هذه الأداة من قبل غير الخبراء، مما ينتج عنه تكنولوجيات قابلة للترجمة بدرجة عالية لاستخدامها في مختبرات علم الأحياء الدقيقة.

يتم عرض النتائج التمثيلية من أجهزة BFI40 و FFI41 النموذجية. يمكن بسهولة الحصول على قياسات معدل نمو Hyphal باستخدام هذه الأجهزة مع تقنيات الفحص المجهري الأساسية. يوضح الشكل 3A-B التفاعلات البكتيرية الفطرية بين C. cinerea hyphae و B. subtilis ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

نظرا لعتامة التربة ، لا يمكن بسهولة تصور التفاعلات بين الميكروبات المكونة لها بدقة خلوية. هنا ، يتم تقديم أداتين للسوائل الدقيقة ، والتي توفر فرصا جديدة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية. الأجهزة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام ، مما يتيح التحكم الزماني المكاني العالي والتصوير عالي الدقة على المستوى الخلوي.

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة المقدمة ، يمكننا فحص التفاعلات الديناميكية بين الفطريات والميكروبات الأخرى مع التحكم المكاني والبيئي الدقيق ، بالإضافة إلى التصوير عالي الدقة على مستوى الخلية الواحدة. الأهم من ذلك ، يمكن حصر النمو الفطري وتوجيهه داخل قناة الموائع الدقيقة. تمكين الحصول على صور بفاصل زمني عالي الجودة.لذلك ، يمكن استكشاف تعقيدات التفاعلات الفطرية والفطرية والبكتيرية. يعد فهم التفاعلات الميكروبية الفطرية خطوة أساسية في تحديد ميكروبيوم التربة والحفاظ عليه. ويمكن استغلال هذه المعرفة لتطوير عوامل جديدة للمكافحة البيولوجية مع الزراعة المستدامة.للبدء ، قم بإعداد ما يقرب من 40 جراما من poly (dimethylsiloxane) أو PDMs ، عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة جيدا بنسبة 10 إلى 1 باستخدام ملعقة في كوب بلاستيكي نظيف. لإزالة جميع فقاعات الهواء ، ضع الكوب في غرفة فراغ لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، باستخدام شريط شفاف ، قم بتأمين القالب الرئيسي في حامل بلاستيكي واستخدم الهواء المصفى المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار ، ثم صب PDMs على وسط القالب الرئيسي والسماح له بالاستقرار.لمنع ترسب جزيئات الغبار على سطح PDMs ، قم بتغطية القالب الرئيسي بشكل فضفاض بغطاء بلاستيكي ، ثم انقل القالب الرئيسي إلى فرن وقم بمعالجته بين عشية وضحاها عند 70 درجة مئوية. بعد إزالة القالب الرئيسي من الفرن والسماح له بالبرودة ، قشر PDMs المعالجة بعيدا عن القالب الرئيسي والإطار البلاستيكي دون إتلاف القالب الرئيسي في PDMs. ثم للحفاظ على سطح خال من الغبار ، ضع شريطا شفافا فوق القنوات الدقيقة المنقوشة في PDMs.بعد ذلك ، استخدم مقصلة مثبتة أو شفرة حلاقة لقطع PDMs إلى ألواح على النحو المحدد في التصميم. عند قطع الفتحة الجانبية للوح PDMs المستخدم في جهاز التفاعل البكتيري الفطري ، أو جهاز BFI ، تأكد من أن القنوات الدقيقة مفتوحة بالكامل. ومع ذلك ، بالنسبة لألواح PDMs المستخدمة في تجميع جهاز التفاعل الفطري الفطري ، أو FFI ، يجب تقليم كل زاوية بحيث تتناسب مع طبق Petri ذي القاع الزجاجي.بعد ذلك ، استخدم قاطعا دقيقا لثقب ثقوب المدخل أو المخرج وفقا لتصميم الجهاز. بعد ذلك ، قم بغمر ألواح PDMs في محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي 0.5. شطف الألواح في الماء المقطر المزدوج المعقم قبل نقلها إلى محلول الإيثانول 70٪.بعد إزالة الإيثانول وشطف الألواح بالماء المعقم المقطر المزدوج مرة أخرى ، اغمر الألواح في ماء مقطر مزدوج معقم وسونيكات لمدة خمس دقائق ، ثم أزل لوح PDMs من الماء ، وجففها بالهواء المصفى المضغوط ، وضعها في طبق بتري مربع معقم. بعد ذلك ، احتضن طبق بتري مع لوح PDMs في فرن عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بمجرد أن تبرد الألواح في بيئة خالية من الغبار ، قم بإزالة أي غبار من سطحها باستخدام الشريط والهواء المصفى المضغوط.لتنشيط أسطح ألواح PDMs وأطباق Petri ذات القاع الزجاجي ، والتي سيتم ربطها لاحقا معا ، ضعها في منظف بلازما مع تنشيط الأسطح لأعلى. بعد إزالة لوح PDMs في أطباق Petri من منظف البلازما ، قم بربطها بلطف عن طريق وضع الأسطح المنشطة في اتصال مطابق مع بعضها البعض. Bond BFI و FFI PDMs بلاطة مع أطباق بتري بأقطار 35 ملم و 55 ملم ، على التوالي للتحقق من الترابط الناجح ، في محاولة لسحب مختبر PDMs من طبق بتري مع ملاقط.تصور الجهاز بعناية بالعين أو بواسطة الفحص المجهري العام لضمان عدم انهيار مداخل التلقيح أو القنوات الدقيقة. بالنسبة للظروف المشبعة بالماء أو الغنية بالمغذيات ، قم بماصة 100 ميكرولتر من المحلول المطلوب لملء أجهزة BFI مباشرة بعد الترابط. بالنسبة لأجهزة FFI ، أضف 30 ميكرولتر من الوسائط إلى كل مدخل.أخيرا ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى طبق بتري للحفاظ على الرطوبة. ومع ذلك ، بالنسبة للظروف غير المشبعة بالماء ، ما عليك سوى إضافة 100 إلى 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى طبق بتري للحفاظ على الرطوبة. بالنسبة للتلقيح الفطري ، داخل غطاء تدفق صفائحي ، باستخدام حفار فلين معقم ، قم بإزالة قابس أجار من مستعمرة على محيط ثقافة عمرها ثلاثة أيام ، مما يضمن الحفاظ على جبهة hyphal المتنامية سليمة.ثم أدخل قابس الأجار في المدخل الفطري لجهاز BFI و / أو FFI مع جانب الميسيليوم لأسفل في جبهة hyphal الموجهة نحو فتحات القنوات الدقيقة لتشجيع تسلل hyphal للقنوات. بالنسبة لجهاز FFI ، أدخل قابس أجار آخر مع نوع فطري ثان في المدخل المقابل. بعد ذلك ، قم بإغلاق طبق بتري بفيلم شفاف واحتضنه عند 25 إلى 28 درجة مئوية في الظلام حتى التصوير.للتلقيح البكتيري ، بعد إزالة جهاز BFI من الحاضنة ، ماصة 10 ميكرولتر من تعليق بكتيري في المدخل البكتيري في بيئة معقمة. بمجرد إغلاق طبق بتري بفيلم شفاف ، قم بتخزين الجهاز في وضع مستقيم عند 25 درجة مئوية في الظلام حتى يبدأ التصوير. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تصور التفاعل بين الفطر Coprinopsis cinerea وبكتيريا Bacillus subtilis بنجاح.لوحظ أنه في وجود البكتيريا ، بدأ معدل نمو الفطريات في الانخفاض بشكل كبير بعد حوالي خمس ساعات من التلقيح المعدني. علاوة على ذلك ، كان لل hyphae الفطرية المرتبطة بالبكتيريا مظهر رقيق وشفاف. كما كشف الفحص المجهري الفلوري بالفاصل الزمني عن انهيار الهيفاي الفطري بعد خمس ساعات من التلقيح المشترك باستخدام Bacillus subtilis.ومع ذلك ، من ست ساعات فصاعدا ، بدأ عدد البكتيريا أيضا في الانخفاض. أظهر تصور التفاعلات الفطرية الفطرية أن Fusarium graminearum يمنع بقوة نمو Trichoderma rossicum ، والذي كان واضحا باستخدام المجهر الفلوري. كما كشف هذا البروتوكول عن تغيرات مورفولوجية كبيرة في فطر Verticillium longisporum في وجود بكتيريا Pseudomonas synxantha و Pseudomonas fluorescens.كما كشفت تقنية التصوير الديناميكي عالية الدقة المستخدمة في الدراسة عن تكوين الحاجز في Fusarium graminearum في وجود الفطر Clonostachys rosea. أتاح وضع العلامات الفلورية التحديد الكمي الديناميكي لانتشار الواصلة الوردية Clonostachys في جهاز FFI. يمكن للمستخدم تكييف هذه الأجهزة وتعديلها لدمج أنواع مختلفة من الاهتمام ومعالجة أسئلتها التجريبية المحددة المتعلقة بالتفاعلات الميكروبية الفطرية.وقد تجاوزت كل من أجهزة BFI و FFI الحدود العلمية ، وكشفت عن كيفية نشر الفطريات لإشارات الدفاع والمواد المغذية عند هجوم الفطريات والفيروسات والديدان الخيطية وتمكين التحقيقات في انتشار البكتيريا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

A فخ هيدرودينامي ميكروفلويديك المستندة للجسيمات واحدة

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

متعدد خطوة الطباعة التصويرية متغير الطول لمحكم بصمام متعدد الأجهزة ميكروفلويديك

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...