Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

我们感谢伦敦帝国理工学院生物工程系和Leverhulme Trust的财政支持（研究资助参考：RPG-2020-352）。

注：此协议中概述的过程摘要直观地显示在 图 2 中。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> 图2：所提出的方法的示意图，由该协议中详述的五个主要部分组成。 设备设计是使用计算机辅助设计（CAD）软件和用光刻制造的主模（1）创建的。这用于浇注聚（二甲...

本文介绍了一种使用通道微流体研究真菌 - 微生物相互作用的方案。作者旨在证明这些设备的多功能性，并鼓励适应研究人员的兴趣。使用示例性BFI和FFI设备，可以比以前更详细地研究真菌 - 微生物相互作用。通过消除土壤的背景复杂性和异质性，减缓菌丝的生长，使它们局限于单个单层，并严格调节环境参数，随着时间的推移，可以捕获这些生物事件的高分辨率图像。使用这些设备，已经使用?...

土壤是一个非常多样化的环境，含有丰富的微生物，有助于碳和磷循环1，2。丝状真菌是许多生态系统的主要组成部分，是有机和无机物质的分解者，可以通过形成共生关系来增强植物的营养3，4。在土壤中，真菌与多种微生物动态相互作用，例如其他真菌5，细菌6，病毒7 和线虫8。这些相互作用对土壤和植物健康具有重大影响。然而，由于缺乏能够对具有高分辨率的相互作用微生物进行成像的适当实验系统，许多系统仍未定义。
关于细菌-真菌相互作用（BFI）和真菌-真菌相互作用（FFI）的研究在一系列领域具有有价值的应用，包括医学中的抗菌剂和农业中的生物控制剂。例如，真菌 Coprinopsis cinerea 产生肽copsin，其已被证明对人病原体 李斯特菌单核细胞增多性9表现出抗菌活性。类似地，真菌衍生的化合物灰黄霉素被广泛用作治疗人类真菌感染的药物，并且还能够抑制植物病原真菌 Alternaria solani10，11的生长。土壤居住细菌 枯草芽孢 杆菌的几种菌株也被证明是真菌植物病原体 根瘤菌Solani 12，13的有效生物防治剂。然而，由于与传统方法相关的局限性，BFI和FFI在单细胞水平上知之甚少。
常规研究通常在宏观尺度上探索BFI和FFI，使用具有两个或更多物种对抗的琼脂平板。通过测量对抗物种14，15，16的生长速率和代谢物产生来评估它们的相互作用;然而，这种方法只能解决到殖民地水平。为了在细胞水平上研究相互作用，可以在涂有琼脂的玻璃显微镜载玻片上培养细菌和真菌接种剂，然后在显微镜下成像17。然而，由于缺乏限制，使用显微镜载玻片跟踪单个菌丝可能很困难，这意味着延时图像更难获得。此外，在这种设置中，不可能有机会在空间上将其他微生物限制在真菌菌丝体的已定义区域内或创建可以扰动的已定义化学环境。土壤的“黑匣子”性质也增加了在单细胞18水平上研究真菌 - 微生物相互作用的复杂性。通过观察远离土壤微生物组令人难以置信的多样性的相互作用物种，可以评估单个成员相互作用的确切方式。因此，对多功能平台的持续需求，以实现BFI和FFI的高分辨率单细胞成像。
微流体技术，即所谓的芯片实验室系统，为在单细胞水平上研究BFI和FFI提供了理想的平台。微流体领域起源于为化学分析和微电子学开发的技术，已被生物科学19采用。微流体技术在定制的微型通道网络中调节少量流体，在微米尺度上至少具有一个维度，并且它们在生物学研究中的应用正在扩大20。特别是，已经开发了微流体装置来检查丝状真菌21，22，23，24，25，26，27，28，29，30的生长。使用该技术的一个好处是，与传统的琼脂方法31相比，菌丝的局限性和微通道内养分的分布更接近土壤环境的结构。最近，微流体平台已被用于研究人类嗜中性粒细胞与真菌病原体32，细菌和植物根33以及真菌和线虫34，35之间的相互作用。
使用微流体研究微生物相互作用的众多优点之一包括对微通道环境的特定控制。例如，可以利用层流状态来产生定义的浓度梯度，这在检查细菌趋化性36时特别有用。另一个优点是聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）（一种廉价的，生物相容性的弹性聚合物，通常用于制造微流体器件）的透明性质，有利于使用明场和荧光显微镜37对单细胞进行高分辨率成像。同样，微生物在微通道内的局限性意味着可以进行跟踪单个细胞的延时实验，从而可以记录和量化单个细胞的反应37。最后，由于微流体装置可以设计为用户友好，因此它们可以很容易地被非专家使用38。
进一步了解土壤微生物之间的相互作用，对于改进可持续生态系统管理做法，以维持生物多样性和减轻气候变化对陆地环境的影响十分重要39.因此，新型微流体工具的开发是在细胞水平上扩展对真菌及其相互作用的理解的基础。此处的协议将重点介绍为研究BFI40和FFI41而生产的两种微流体装置，如图 1所示。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> 图 1：细菌-真菌相互作用 （BFI） 和真菌-真菌相互作用 （FFI） 装置的视觉和示意图。 （A） BFI 装置的图像。在微通道一端的入口处放置一个菌丝塞，以允许菌丝生长进入设备。细菌入口位于另一端。比例尺= 5 mm. （B） BFI装置的示意图概述，描绘了细菌入口的位置和通过相互作用微通道的菌丝生长方向。通道深度为10 μm，宽100 μm，长7 mm，共有28个观察通道。（C）在 栉 水母和 枯草芽孢杆菌 NCIB 3610之间的琼脂平板上进行对抗试验，比例尺= 20 mm（左）。显微镜图像显示C . cinerea 和 枯草芽孢杆菌 NCIB 3610在微通道（中间和右侧）内的相互作用，即细菌与真菌菌丝的极性附着。比例尺 = 25 μm（中）和 10 μm（右）。（D）FFI装置粘合到玻璃底培养皿上的图像，用菌丝塞双重接种。比例尺 = 1 cm. （E） FFI 设备的原理图概述。两个真菌孕育剂塞子被引入设备两端的入口，允许对微通道进行菌丝探索。控制通道仅连接到一个真菌入口，并具有死端通道，从而防止测试真菌之间的相互作用。相互作用通道连接两个真菌入口，并允许微通道内测试对象之间的菌丝相互作用。每个相互作用通道由18个菱形部分组成，总长度为8.8毫米（每颗钻石490 x 430μm），深10μm，每颗金刚石之间有一个20μm的连接区域。通道类型是重复的，比例尺 = 1 mm.（F） 两个接近的菌丝前沿之间的相互作用区，从相互连接的相互作用通道的两端增长。相差显微镜图像，比例尺= 250μm。该图中的面板已从Stanley等人，2014（A-C）40 和Gimeno等人，2021（D-F）41进行了修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

丝状真菌是土壤的成功居民，在土壤生态系统中起着重要作用，例如有机和无机物质的分解以及养分水平的调节。在那里，他们还发现了许多与各种其他微生物（如细菌或其他真菌）相互作用的机会。然而，由于土壤的黑匣子性质，在细胞水平上研究真菌相互作用可能具有挑战性。正在开发新的微流体工具，用于研究真菌相互作用;突出显示了两个旨在研究细菌 - 真菌和真菌 - 真菌相互作用的平台。在这些微通道中，可以在受控的物理化学环境中以比以前更高的时间和空间分辨率监测真菌 - 微生物相互作用。这些工具的应用产生了许多新的生物学见解，例如观察细菌对菌丝的极性附着或揭示未表征的真菌 - 真菌拮抗作用。这些方法的一个关键特征是非专家易于使用该工具，从而产生了用于微生物实验室的高度可翻译的技术。

代表性的结果来自示例性 BFI40 和 FFI41 设备。使用这些设备结合基本的显微镜技术可以很容易地获得菌丝生长速率测量值。图3A-B说明了C. cinerea hyphae和枯草芽孢杆菌NCIB 3610之间的细菌 - 真菌相互作用。枯草芽孢杆菌的存在在共同接种后约5小时后阻止了C. cinerea的生长（图3B...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

由于土壤的不透明度，其组成微生物之间的相互作用不能用细胞分辨率轻松可视化。在这里，介绍了两种微流体工具，它们为研究真菌 - 微生物相互作用提供了新的机会。这些器件用途广泛且易于使用，可在细胞水平上实现高时空控制和高分辨率成像。

用于在细胞水平上探测真菌 - 微生物相互作用的微流体工具

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

使用所提出的微流体装置，我们可以通过精确的空间和环境控制以及单细胞水平的高分辨率成像来检查真菌与其他微生物之间的动态相互作用。重要的是，真菌的生长可以被限制和引导在微流体通道内。能够获得高质量的延时图像。因此，可以探索真菌 - 真菌和真菌 - 细菌相互作用的复杂性。了解真菌微生物相互作用是定义和保护土壤微生物组的重要步骤。这些知识可用于开发具有可持续农业的新型生物防治剂。首先，制备约40克聚（二甲基硅氧烷）或PDM，方法是在干净的塑料杯中使用刮刀以10比1的比例将碱和固化剂彻底混合。要去除所有气泡，请将杯子放入真空室中一小时。接下来，使用透明胶带将母模固定在塑料支架中，并使用压缩过滤空气去除任何灰尘颗粒，然后将PDM倒入主模的中心并使其沉降。为了防止灰尘颗粒在PDM表面上沉降，用塑料盖松散地覆盖主模具，然后将主模具转移到烤箱中并在70摄氏度下固化过夜。从烤箱中取出主模并使其冷却后，将固化的PDM从主模和塑料框架上剥离，而不会损坏PDM中的主模。然后，为了保持无尘表面，将透明胶带放在压花到PDM中的微通道上。接下来，使用安装的断头台或剃须刀片将PDM切割成设计指定的板坯。当切割用于细菌 - 真菌相互作用装置或BFI装置的PDM板的横向开口时，确保微通道完全打开。但是，对于用于组装真菌 - 真菌相互作用装置或FFI的PDM板，应修剪每个角，使其适合玻璃底培养皿。接下来，使用精密切割机根据设备设计冲孔或出孔。接下来，将PDM板浸入0.5摩尔氢氧化钠溶液中。在将板坯转移到70%乙醇溶液中之前，用无菌的双蒸馏水冲洗板坯。除去乙醇并再次用双蒸馏无菌水冲洗板坯后，将板浸入无菌双蒸馏水和超声处理液中五分钟，然后从水中取出PDM板，用压缩过滤空气干燥，并将其置于无菌方形培养皿中。接下来，将培养皿与PDM板一起在70摄氏度的烤箱中孵育一小时。一旦板坯在无尘环境中冷却，使用胶带和压缩过滤空气清除其表面的任何灰尘。要激活PDM板和玻璃底培养皿的表面，随后将它们粘合在一起，将它们放在等离子体清洁器中，要激活的表面朝上。从等离子体清洁器中取出培养皿中的PDM板后，通过将激活的表面彼此保形接触来轻轻粘合它们。将BFI和FFI PDMs板分别与直径为35毫米和55毫米的培养皿粘合，以检查粘合成功，请尝试用镊子将PDM实验室从其培养皿上拉下来。用眼睛或普通显微镜仔细观察设备，以确保接种入口或微通道不会塌陷。对于水饱和或营养丰富的条件，移液100微升所需的溶液，以在粘合后立即填充BFI设备。对于 FFI 设备，在每个入口中加入 30 微升介质。最后，向培养皿中加入100至200微升无菌双蒸馏水以保持湿度。但是，对于水不饱和条件，只需向培养皿中加入100至200微升无菌双蒸馏水即可保持湿度。对于真菌接种，在层流罩内，使用无菌的软木螟，从三天龄培养物外围的菌落中取出琼脂塞，确保保持生长的菌丝前部完好无损。然后将琼脂塞引入BFI和/或FFI装置的真菌入口，菌丝体一面朝下，在菌丝体前部朝向微通道开口，以鼓励通道的菌丝浸润。对于FFI设备，将另一个带有第二种真菌的琼脂塞引入相反的入口。接下来，用透明薄膜密封培养皿，并在25至28摄氏度的黑暗中孵育，直到成像。对于细菌接种，从培养箱中取出BFI装置后，在无菌环境中将10微升细菌悬浮液移液到细菌入口中。用透明薄膜密封培养皿后，将设备直立存放在25摄氏度的黑暗中，直到成像开始。使用该协议，可以成功可视化真菌Coprinopsis cinerea和枯草芽孢杆菌之间的相互作用。观察到在细菌存在的情况下，在共同接种约五个小时后，真菌的生长速率开始急剧下降。此外，与细菌相关的真菌菌丝具有薄而透明的外观。延时荧光显微镜检查还显示，枯草芽孢杆菌共接种5小时后真菌菌丝塌陷。然而，从六个小时开始，细菌数量也开始下降。真菌 - 真菌相互作用的可视化表明，镰刀菌强烈抑制了红木霉的生长，这在荧光显微镜下很明显。该方案进一步揭示了在细菌Synxantha假单胞菌和荧光假单胞菌存在的情况下真菌黄萎病的显着形态学变化。该研究中使用的高分辨率动态成像技术还揭示了在真菌Clonostachys rosea存在的情况下，禾谷镰刀菌中的隔膜形成。荧光标记提供了FFI装置中玫瑰梭菌菌增殖的动态定量。这些设备可以由用户进行调整和修改，以结合感兴趣的不同物种，并解决其关于真菌微生物相互作用的特定实验问题。BFI和FFI设备都推动了科学前沿，揭示了真菌如何在真菌，病毒，线虫的攻击下传播防御信号和营养物质，并能够对细菌传播进行研究。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

一个单粒子为基础的微流控液力陷阱

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

科研

生物工程

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

粘附频率含量为原位跨交界的分子相互作用，在细胞与细胞界面的动力学分析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

在活细胞中的小GTPase活性时空操纵在亚细胞水平上几秒钟的时间刻度

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

通过胎盘的外来物质和纳米材料的运输率测定<em&gt;体外</em&gt;人胎盘灌注型号

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

脂质双层囊泡代使用微流控喷射

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

活微生物组共培养与人的微工程肠绒毛在肠道上一个芯片微流体装置

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

设计微流体装置用于研究细胞反应在单人或共存化工/电气/剪切应力刺激

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

用的表面图案化微流体系统用于在单细胞水平调查空泡（S） - 细胞的相互作用及产生的生物效应

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

多级可变高度的光刻多层带瓣微流体装置

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...