Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Vi anerkender økonomisk støtte fra Institut for Bioengineering ved Imperial College London og The Leverhulme Trust (Forskningsbevillingsreference: RPG-2020-352).

BEMÆRK: Et resumé af de procedurer, der er skitseret i denne protokol, er visuelt afbildet i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk repræsentation af den præsenterede metode bestående af fem hovedafsnit, der er beskrevet i denne protokol. Enhedsdesign oprettes ved hjælp af CAD-software (Computer A...

Denne artikel præsenterer en protokol til undersøgelse af svampe-mikrobielle interaktioner ved hjælp af kanalmikrofluidik. Forfatterne sigter mod at demonstrere alsidigheden af disse enheder og tilskynde til tilpasning, der passer til forskerens interesser. Ved hjælp af de eksemplariske BFI- og FFI-enheder kan svampe-mikrobielle interaktioner studeres mere detaljeret end tidligere tilgængelig. Ved at fjerne jordens baggrundskompleksitet og heterogenitet, moderere væksten af hyfer, så de er begrænset til et enkelt...

Jordbunden er et usædvanligt forskelligartet miljø, der indeholder en overflod af mikroorganismer, der er medvirkende til kulstof- og fosforcyklusser 1,2. Filamentøse svampe er en vigtig bestanddel af talrige økosystemer som nedbrydere af organisk og uorganisk materiale og kan forbedre plantens ernæring gennem dannelse af symbiotiske forhold 3,4. Inden for jord interagerer svampe dynamisk med en lang række mikrober såsom andre svampe5, bakterier6, vira7 og nematoder8. Disse interaktioner har betydelige konsekvenser for jord- og plantesundheden. Men på grund af mangel på passende eksperimentelle systemer, der er i stand til at billeddanne interagerende mikroorganismer med høj opløsning, forbliver mange udefinerede.
Undersøgelser vedrørende bakterie-svampeinteraktioner (BFI'er) og svampe-svampeinteraktioner (FFI'er) har værdifulde anvendelser på en række områder, herunder antimikrobielle stoffer i medicin og biologiske bekæmpelsesmidler i landbruget. For eksempel producerer svampen Coprinopsis cinerea peptidet copsin, som har vist sig at udvise antibakteriel aktivitet mod det humane patogen Listeria monocytogenes9. Tilsvarende anvendes den svampeafledte forbindelse, griseofulvin, i vid udstrækning som behandling for humane svampeinfektioner og er desuden i stand til at hæmme væksten af den plantepatogene svamp Alternaria solani10,11. Flere stammer af den jordboende bakterie Bacillus subtilis har også vist sig at være effektive biokontrolmidler af svampeplantepatogenet Rhizoctonia solani12,13. På grund af begrænsninger forbundet med traditionelle metoder forstås BFI'er og FFI'er ikke desto mindre dårligt på niveau med enkeltceller.
Konventionelle undersøgelser undersøger typisk BFI'er og FFI'er på makroskalaen ved hjælp af agarplader med to eller flere arter i konfrontation. Deres interaktion vurderes ved at måle vækstrater og metabolitproduktion af de konfronterende arter 14,15,16; denne metode er dog kun løst til koloniniveau. For at studere interaktioner på celleniveau kan bakterie- og svampeinokulanter dyrkes på glasmikroskopglas belagt med agar, der derefter afbildes under et mikroskop17. Ikke desto mindre kan det være svært at følge en enkelt hypha ved hjælp af mikroskop dias på grund af manglende indeslutning, hvilket betyder, at time-lapse-billeder er sværere at få. Endvidere er muligheden for rumligt at begrænse andre mikroorganismer inden for definerede områder af svampemyceliet eller skabe definerede kemiske miljøer, der for eksempel kan forstyrres, ikke mulig i sådanne opsætninger. Jordens "sorte boks" natur øger også kompleksiteten ved at studere svampe-mikrobielle interaktioner på niveau med enkeltceller18. Ved at observere interagerende arter væk fra den utrolige mangfoldighed af jordmikrobiomet kan den nøjagtige måde, hvorpå individuelle medlemmer interagerer, vurderes. Der er således et fortsat behov for alsidige platforme, der muliggør høj opløsning, enkeltcellebilleddannelse af BFI'er og FFI'er.
Mikrofluidiske teknologier, såkaldte lab-on-a-chip-systemer, giver en ideel platform til undersøgelse af BFI'er og FFI'er på niveau med enkeltceller. Mikrofluidikområdet, der stammer fra teknologier udviklet til kemisk analyse og mikroelektronik, er blevet vedtaget af de biologiske videnskaber19. Mikrofluidiske teknologier regulerer små mængder væsker inden for et skræddersyet netværk af miniaturiserede kanaler, der har mindst en dimension på mikrometerskalaen, og deres anvendelse i biologisk forskning udvides20. Især er mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at undersøge væksten af filamentøse svampe 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fordel ved at bruge denne teknologi er, at indeslutning af hyfer og fordelingen af næringsstoffer inden for mikrokanaler mere ligner jordmiljøets struktur end konventionelle agarmetoder31. For nylig er mikrofluidiske platforme blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem humane neutrofiler og svampepatogener32, bakterier og planterødder33 samt svampe og nematoder34,35.
En af de mange fordele ved at bruge mikrofluidik til undersøgelse af mikrobielle interaktioner inkluderer den specifikke kontrol af mikrokanalmiljøet. For eksempel kan laminære flowregimer udnyttes til at generere definerede koncentrationsgradienter, hvilket er særligt nyttigt ved undersøgelse af bakteriel kemotaxis36. En anden fordel er, at den gennemsigtige karakter af poly (dimethylsiloxan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomer polymer, der almindeligvis anvendes til fremstilling af mikrofluidiske enheder, letter billeddannelse i høj opløsning af enkeltceller ved hjælp af brightfield og fluorescensmikroskopi37. Ligeledes betyder indeslutning af mikrober inden for mikrokanaler, at time-lapse-eksperimenter, der sporer enkeltceller, kan udføres, hvilket gør det muligt at registrere og kvantificere individuelle cellulære reaktioner37. Da mikrofluidiske anordninger kan designes til at være brugervenlige, kan de endelig let anvendes af ikke-eksperter38.
Det er vigtigt at fremme viden om samspillet mellem jordboende mikroorganismer for at forbedre bæredygtig økosystemforvaltningspraksis, der opretholder biodiversiteten og afbøder klimaændringernes indvirkning på terrestriske miljøer39. Udviklingen af nye mikrofluidiske værktøjer er således grundlæggende for at udvide forståelsen af svampe og deres interaktioner på celleniveau. Protokollen her vil fokusere på to mikrofluidiske enheder produceret til undersøgelse af BVI40 og FFI'er41 som repræsenteret i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figur 1: Visuel og skematisk repræsentation af bakterie-svampeinteraktion (BFI) og svampe-svampeinteraktion (FFI) enheder. (A) Billede af BFI-enheden. Et mycelstik placeres ved indgangen til den ene ende af mikrokanalerne for at tillade hyphal vækst i enheden. Bakterieindløbet er i den modsatte ende. Skalabjælke = 5 mm. (B) Skematisk oversigt over BFI-enheden, der viser placeringen af bakterieindløbene og retningen af bindestregsvækst gennem interaktionsmikrokanalerne. Kanalerne er 10 μm i dybden, 100 μm brede og 7 mm lange med i alt 28 observationskanaler. (C) Konfrontationsassay på agarplade mellem Coprinopsis cinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610, skalastang = 20 mm (venstre). Mikroskopibilleder, der viser interaktionen mellem C. cinerea og B. subtilis NCIB 3610 inden for mikrokanalen (midten og højre), dvs. polær vedhæftning af bakterier til svampehyfer. Skalabjælke = 25 μm (midten) og 10 μm (højre). (D) Billede af FFI-enheden bundet til en petriskål med glasbund, dobbelt podet med mycelpropper. Skalabjælke = 1 cm. (E) Skematisk oversigt over FFI-enheden. To svampeinokulantpropper indføres i indløbene i hver ende af enheden, hvilket tillader hyphal udforskning af mikrokanalerne. Kontrolkanaler er kun forbundet med et svampeindløb og har en blindgydekanal, hvilket forhindrer interaktioner mellem testsvampene. Interaktionskanaler forbinder begge svampeindløb og tillader bindestregsinteraktioner mellem forsøgspersonerne inden for mikrokanalen. Hver interaktionskanal består af 18 diamantformede sektioner, der måler en samlet længde på 8,8 mm (490 x 430 μm pr. Diamant), 10 μm dyb og har et forbindelsesområde mellem hver diamant på 20 μm. Kanaltyper duplikeres, skalabjælker = 1 mm. (F) Interaktionszone mellem to nærliggende bindestregfronter, der vokser fra modsatte ender af den sammenkoblede interaktionskanal. Fasekontrastmikroskopibillede, skalabjælke = 250 μm. Panelerne i denne figur er blevet ændret fra Stanley et al., 2014 (A-C)40 og Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Filamentøse svampe er vellykkede indbyggere i jorden og spiller en vigtig rolle i jordens økosystemer, såsom i nedbrydning af organisk og uorganisk materiale samt regulering af næringsstofniveauer. Der finder de også mange muligheder for at interagere med en række andre mikrober såsom bakterier eller andre svampe. At studere svampeinteraktioner på celleniveau kan dog være udfordrende på grund af jordens sorte bokslignende natur. Nye mikrofluidiske værktøjer udvikles til undersøgelse af svampeinteraktioner; to platforme designet til at studere interaktioner mellem bakterie-svampe og svampe-svampe fremhæves. Inden for disse mikrokanaler kan svampe-mikrobielle interaktioner overvåges i kontrollerede fysisk-kemiske miljøer ved højere tidsmæssig og rumlig opløsning end tidligere muligt. Anvendelsen af disse værktøjer har givet adskillige nye biologiske indsigter, såsom observation af bakteriel polær tilknytning til hyfer eller afsløring af ukarakteriserede svampe-svampemodsætninger. Et centralt træk ved disse metoder vedrører brugervenligheden af dette værktøj af ikke-eksperter, hvilket giver meget omsættelige teknologier til brug i mikrobiologiske laboratorier.

Repræsentative resultater præsenteres fra de eksemplariske BFI40- og FFI41-enheder. Hyphal væksthastighedsmålinger kan let opnås ved hjælp af disse enheder i kombination med grundlæggende mikroskopiteknikker. Figur 3A-B illustrerer bakterielle-svampeinteraktioner mellem C. cinerea hyphae og B. subtilis NCIB 3610. Tilstedeværelsen af B. subtilis standser væksten af C. cine...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

På grund af jordens uigennemsigtighed kan interaktioner mellem dets bestanddele ikke let visualiseres med cellulær opløsning. Her præsenteres to mikrofluidiske værktøjer, som giver nye muligheder for at undersøge svampe-mikrobielle interaktioner. Enhederne er alsidige og enkle at bruge, hvilket muliggør høj spatiotemporal kontrol og billeddannelse i høj opløsning på mobilniveau.

Mikrofluidiske værktøjer til sondering af svampe-mikrobielle interaktioner på celleniveau

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Ved hjælp af de præsenterede mikrofluidiske enheder kan vi undersøge dynamiske interaktioner mellem svampe og andre mikrober med præcis rumlig og miljømæssig kontrol samt billeddannelse i høj opløsning på enkeltcelleniveau. Det er vigtigt, at svampevækst kan begrænses og styres inden for den mikrofluidiske kanal. Gør det muligt at få time lapse-billeder i høj kvalitet.Derfor kan kompleksiteten af svampe-svampe- og svampebakterie-interaktioner undersøges. Forståelse af svampemikrobielle interaktioner er et vigtigt skridt i at definere og bevare jordens mikrobiom. Denne viden kan udnyttes til udvikling af nye biokontrolmidler med bæredygtigt landbrug.Til at begynde med skal du forberede ca. 40 gram poly (dimethylsiloxan) eller PPM'er ved grundigt at blande basen og hærdningsmidlet i et forhold på 10 til 1 ved hjælp af en spatel i en ren plastikkop. For at fjerne alle luftbobler skal du placere koppen i et vakuumkammer i en time. Derefter skal du ved hjælp af klar tape fastgøre masterformen i en plastbeslag og bruge komprimeret filtreret luft til at fjerne støvpartikler, hæld derefter PDM'erne på midten af masterformen og lad den sætte sig.For at forhindre bundfældning af støvpartikler på PDMs overflade skal du dække masterformen løst med et plastlåg, derefter overføre masterformen til en ovn og hærde natten over ved 70 grader Celsius. Når du har fjernet masterformen fra ovnen og ladet den køle af, skal du skrælle de hærdede PPM'er væk fra masterformen og plastrammen uden at beskadige masterformen i PDM'erne. For at opretholde en støvfri overflade skal du placere klar tape over mikrokanalerne præget i PDM'erne.Brug derefter en monteret guillotine eller et barberblad til at skære PDM'erne i plader som angivet af designet. Når du skærer den laterale åbning af PDMs-pladen, der bruges til bakterie-svampeinteraktionsenheden eller BFI-enheden, skal du sikre dig, at mikrokanalerne er helt åbne. For PDMs plader, der anvendes til samling af svampe-svampeinteraktionsanordningen eller FFI, skal hvert hjørne trimmes, så det passer ind i en petriskål med glasbund.Brug derefter en præcisionsskærer til at stanse indløbs- eller udløbshuller i henhold til enhedens design. Derefter nedsænkes PPM-pladerne i en 0,5 molær natriumhydroxidopløsning. Skyl pladerne i sterilt dobbeltdestilleret vand, inden de overføres til en 70% ethanolopløsning.Efter fjernelse af ethanolen og skylning af pladerne med dobbeltdestilleret sterilt vand igen, nedsænk pladerne i sterilt dobbeltdestilleret vand og sonikere i fem minutter, fjern derefter PDM-pladen fra vandet, tør dem med komprimeret filtreret luft og læg dem i en steril firkantet petriskål. Derefter inkuberes petriskålen med PDPM-plader i en ovn ved 70 grader Celsius i en time. Når pladerne er afkølet i et støvfrit miljø, skal du fjerne støv fra overfladen ved hjælp af tape og komprimeret filtreret luft.For at aktivere overfladerne på PDMs plader og glasbund petriskåle, som efterfølgende vil blive bundet sammen, skal du placere dem i en plasmarenser med overfladerne, der skal aktiveres opad. Når pdm-pladen i petriskålene er fjernet fra plasmarenseren, skal du binde dem forsigtigt ved at placere de aktiverede overflader i konform kontakt med hinanden. Bond BFI og FFI PDMs plade med petriskåle på henholdsvis 35 millimeter og 55 millimeter diametre, for at kontrollere den vellykkede limning, prøv at trække PDMs lab af sin petriskål med pincet.Visualiser enheden omhyggeligt med øjet eller ved generisk mikroskopi for at sikre, at podningsindtagene eller mikrokanalerne ikke kollapser. For vandmættede eller næringsrige forhold pipetteres 100 mikroliter af den ønskede opløsning for at fylde BFI-enheder umiddelbart efter binding. For FFI-enheder skal du tilføje 30 mikroliter af mediet til hvert indløb.Til sidst tilsættes 100 til 200 mikroliter sterilt dobbeltdestilleret vand til petriskålen for at opretholde fugtigheden. Men for umættede vandforhold skal du blot tilføje 100 til 200 mikroliter sterilt dobbeltdestilleret vand til petriskålen for at opretholde fugtigheden. Til svampevaccination skal du inde i en laminær strømningshætte ved hjælp af en steriliseret korkborer fjerne en agarprop fra en koloni i periferien af en tre dage gammel kultur og sikre at holde den voksende bindestregfront intakt.Indfør derefter agarproppen i svampeindløbet på BFI- og / eller FFI-enheden med myceliumsiden nedad i bindestregsfronten orienteret mod mikrokanalåbningerne for at tilskynde til hyphalinfiltration af kanalerne. For FFI-enheden skal du introducere et andet agarstik med en anden svampeart i det modsatte indløb. Forsegl derefter petriskålen med en gennemsigtig film og inkuberes ved 25 til 28 grader Celsius i mørke indtil billeddannelse.Til bakteriel podning, efter at BFI-enheden er fjernet fra inkubatoren, pipetteres 10 mikroliter af en bakteriel suspension i bakterieindløbet i et sterilt miljø. Når petriskålen er forseglet med en gennemsigtig film, opbevares enheden lodret ved 25 grader Celsius i mørke, indtil billeddannelsen begynder. Ved hjælp af denne protokol kunne interaktionen mellem svampen Coprinopsis cinerea og bakterien Bacillus subtilis visualiseres med succes.Det blev observeret, at svampens væksthastighed i nærværelse af bakterien begyndte at falde drastisk efter ca. fem timers kakumulering. Desuden havde svampehyphae forbundet med bakterierne et tyndt og gennemsigtigt udseende. Time lapse fluorescensmikroskopi afslørede også svampehyferkollaps efter fem timers kakumulering med Bacillus subtilis.Men fra seks timer og fremefter begyndte bakteriepopulationen også at falde. Visualisering af svampe-svampeinteraktioner viste, at Fusarium graminearum stærkt hæmmede væksten af Trichoderma rossicum, hvilket var tydeligt ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Denne protokol afslørede yderligere signifikante morfologiske ændringer i svampen Verticillium longisporum i nærværelse af bakterier Pseudomonas synxantha og Pseudomonas fluorescens.Den dynamiske billeddannelsesteknik med høj opløsning, der blev anvendt i undersøgelsen, afslørede også septadannelse i Fusarium graminearum i nærværelse af svampen Clonostachys rosea. Fluorescensmærkning gav den dynamiske kvantificering af Clonostachys rosea hyphal proliferation i FFI-enheden. Disse enheder kan tilpasses og modificeres af brugeren til at inkorporere forskellige arter af interesse og løse deres specifikke eksperimentelle spørgsmål vedrørende svampemikrobielle interaktioner.Både BFI- og FFI-enhederne har skubbet videnskabelige grænser og afsløret, hvordan svampe formerer forsvarssignaler og næringsstoffer ved angreb fra svampe, virus, nematoder og muliggør undersøgelser af bakteriel spredning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Vedhæftning Frekvens Assay for In Situ Kinetics Analyse af Cross-Junctional molekylære interaktioner i celle-celle-grænseflade

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-tidsmæssige Manipulation af Lille GTPase aktivitet på Subcellulær niveau og på Tidsplan for Seconds i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestemmelse af transport Rate af Xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjælp af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelige placentaperfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitative og Temporal Kontrol af ilt mikromiljø på det indre Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur af Living microbiome med Microengineered Menneskelig Intestinal Villi i en Gut-on-a-Chip mikrofluidanordning

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Design mikrofluidenheder for at studere cellulære reaktioner under ét eller samtidig eksisterende Chemical / El / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikrofluidsystem med Surface mønster for Undersøgelse Kavitation Bubble (r)-Cell Interaktion og de resulterende bioeffekter på Single-celle niveau

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...