Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

We erkennen financiële steun van het Department of Bioengineering van Imperial College London en The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

OPMERKING: Een samenvatting van de procedures die in dit protocol worden beschreven, wordt visueel weergegeven in figuur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de gepresenteerde methodologie bestaande uit vijf belangrijke secties die in dit protocol worden beschreven. Apparaatontwerpen worden...

Dit artikel presenteert een protocol voor de studie van schimmel-microbiële interacties met behulp van kanaalmicrofluïdica. De auteurs willen de veelzijdigheid van deze apparaten aantonen en aanpassing aanmoedigen om aan de interesses van de onderzoeker te voldoen. Met behulp van de voorbeeld BFI- en FFI-apparaten kunnen schimmel-microbiële interacties in meer detail worden bestudeerd dan voorheen toegankelijk was. Door de achtergrondcomplexiteit en heterogeniteit van de bodem te verwijderen, de groei van schimmeldrad...

De bodem is een uitzonderlijk diverse omgeving met een overvloed aan micro-organismen die een belangrijke rol spelen voor koolstof- en fosforcycli 1,2. Filamenteuze schimmels zijn een belangrijk onderdeel van talrijke ecosystemen als afbrekers van organische en anorganische materie en kunnen de voeding van planten verbeteren door de vorming van symbiotische relaties 3,4. In de bodem interageren schimmels dynamisch met een veelheid aan microben zoals andere schimmels5, bacteriën6, virussen7 en nematoden8. Deze interacties hebben aanzienlijke gevolgen voor de bodem- en plantgezondheid. Maar als gevolg van een gebrek aan geschikte experimentele systemen die in staat zijn om interagerende micro-organismen met hoge resolutie in beeld te brengen, blijven velen ongedefinieerd.
Onderzoeken met betrekking tot bacteriële-schimmelinteracties (BFI's) en schimmel-schimmelinteracties (FFI's) hebben waardevolle toepassingen op verschillende gebieden, waaronder antimicrobiële stoffen in de geneeskunde en biologische bestrijders in de landbouw. De schimmel Coprinopsis cinerea produceert bijvoorbeeld het peptide copsine, waarvan is aangetoond dat het antibacteriële activiteit vertoont tegen de menselijke ziekteverwekker Listeria monocytogenes9. Evenzo wordt de van schimmel afgeleide verbinding, griseofulvine, veel gebruikt als behandeling voor menselijke schimmelinfecties en is bovendien in staat om de groei van de plantpathogene schimmel Alternaria solani10,11 te remmen. Verschillende stammen van de bodembewonende bacterie Bacillus subtilis zijn ook effectieve biocontrolemiddelen gebleken van de schimmelplantpathogeen Rhizoctonia solani12,13. Niettemin, als gevolg van beperkingen in verband met traditionele methodologieën, worden BFI's en FFI's slecht begrepen op het niveau van enkele cellen.
Conventionele studies onderzoeken meestal BFI's en FFI's op macroschaal met behulp van agarplaten met twee of meer soorten in confrontatie. Hun interactie wordt beoordeeld door het meten van groeisnelheden en metabolietproductie van de confronterende soort 14,15,16; deze methodologie wordt echter alleen opgelost tot op kolonieniveau. Om interacties op cellulair niveau te bestuderen, kunnen bacteriële en schimmelinoculanten worden gekweekt op glazen microscoopglaasjes bedekt met agar die vervolgens worden afgebeeld onder een microscoop17. Niettemin kan het moeilijk zijn om een enkele hypha te volgen met behulp van microscoopglaasjes vanwege een gebrek aan opsluiting, wat betekent dat time-lapse-beelden moeilijker te verkrijgen zijn. Verder is de mogelijkheid om andere micro-organismen ruimtelijk op te sluiten binnen gedefinieerde gebieden van het schimmelmycelium of gedefinieerde chemische omgevingen te creëren die bijvoorbeeld kunnen worden verstoord, niet mogelijk in dergelijke opstellingen. De "black box" aard van de bodem draagt ook bij aan de complexiteit van het bestuderen van schimmel-microbiële interacties op het niveau van enkele cellen18. Door interagerende soorten te observeren, weg van de ongelooflijke diversiteit van het bodemmicrobioom, kan de exacte manier waarop individuele leden met elkaar omgaan worden beoordeeld. Er is dus een voortdurende behoefte aan veelzijdige platforms die hoge-resolutie, single-cell imaging van BFI's en FFI's mogelijk maken.
Microfluïdische technologieën, zogenaamde lab-on-a-chip-systemen, bieden een ideaal platform voor de studie van BFI's en FFI's op het niveau van enkele cellen. Het gebied van microfluïdica, afkomstig van technologieën die zijn ontwikkeld voor chemische analyse en micro-elektronica, is overgenomen door de biologische wetenschappen19. Microfluïdische technologieën reguleren kleine hoeveelheden vloeistoffen binnen een op maat gemaakt netwerk van geminiaturiseerde kanalen, met ten minste één dimensie op micrometerschaal, en hun gebruik in biologisch onderzoek breidt zich uit20. In het bijzonder zijn microfluïdische apparaten ontwikkeld om de groei van filamenteuze schimmels 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 te onderzoeken. Een voordeel van het gebruik van deze technologie is dat de opsluiting van schimmeldraden en de verdeling van voedingsstoffen in microkanalen meer lijkt op de structuur van het bodemmilieu dan conventionele agarmethoden31. Onlangs zijn microfluïdische platforms gebruikt om interacties tussen menselijke neutrofielen en schimmelpathogenen32, bacteriën en plantenwortels33, evenals schimmels en nematoden34,35 te onderzoeken.
Een van de vele voordelen van het gebruik van microfluïdica voor het bestuderen van microbiële interacties omvat de specifieke controle van de microkanaalomgeving. Laminaire stromingsregimes kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om gedefinieerde concentratiegradiënten te genereren, wat vooral handig is bij het onderzoeken van bacteriële chemotaxis36. Een ander voordeel is dat de transparante aard van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS), een goedkoop, biocompatibel elastomeerpolymeer dat vaak wordt gebruikt bij de vervaardiging van microfluïdische apparaten, beeldvorming met hoge resolutie van afzonderlijke cellen met behulp van brightfield- en fluorescentiemicroscopiemogelijk maakt 37. Evenzo betekent de opsluiting van microben in microkanalen dat time-lapse-experimenten kunnen worden uitgevoerd die afzonderlijke cellen volgen, waardoor individuele cellulaire reacties kunnen worden geregistreerd en gekwantificeerd37. Ten slotte, aangezien microfluïdische apparaten kunnen worden ontworpen om gebruiksvriendelijk te zijn, kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt door niet-experts38.
Het bevorderen van de kennis van de interacties tussen bodembewonende micro-organismen is belangrijk voor het verbeteren van duurzame ecosysteembeheerpraktijken die de biodiversiteit in stand houden en om de gevolgen van klimaatverandering voor terrestrische milieus te beperken39. De ontwikkeling van nieuwe microfluïdische hulpmiddelen is dus van fundamenteel belang om het begrip van schimmels en hun interacties op cellulair niveau uit te breiden. Het protocol hier zal zich richten op twee microfluïdische apparaten die zijn geproduceerd voor de studie van BFI's40 en FFI's41 zoals weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figuur 1: Visuele en schematische weergave van de bacteriële-schimmelinteractie (BFI) en schimmel-schimmelinteractie (FFI) apparaten. (A) Afbeelding van het BFI-apparaat. Een myceliale plug wordt geplaatst bij de ingang van het ene uiteinde van de microkanalen om hyphale groei in het apparaat mogelijk te maken. De bacteriële inlaat bevindt zich aan de andere kant. Schaalbalk = 5 mm. (B) Schematisch overzicht van het BFI-apparaat, met de positionering van de bacteriële inlaten en de richting van de hyphale groei door de interactiemicrokanalen. De kanalen zijn 10 μm diep, 100 μm breed en 7 mm lang, met in totaal 28 observatiekanalen. (C) Confrontatietest op agarplaat tussen Coprinopsis cinerea en Bacillus subtilis NCIB 3610, schaalbalk = 20 mm (links). Microscopiebeelden die de interactie tonen tussen C. cinerea en B. subtilis NCIB 3610 binnen het microkanaal (midden en rechts), d.w.z. polaire aanhechting van bacteriën aan schimmeldraden. Schaalbalk = 25 μm (midden) en 10 μm (rechts). (D) Afbeelding van het FFI-apparaat dat is verbonden met een petrischaal met glazen bodem, dubbel ingeënt met myceliale pluggen. Schaalbalk = 1 cm. (E) Schematisch overzicht van het FFI-apparaat. Twee schimmelinoculante pluggen worden in de inlaten aan beide uiteinden van het apparaat gebracht, waardoor hyphale exploratie van de microkanalen mogelijk is. Controlekanalen zijn slechts verbonden met één schimmelinlaat en hebben een doodlopend kanaal, waardoor interacties tussen de testschimmels worden voorkomen. Interactiekanalen verbinden beide schimmelinlaten en maken hyphale interacties tussen de proefpersonen in het microkanaal mogelijk. Elk interactiekanaal bestaat uit 18 diamantvormige secties, met een totale lengte van 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm diep en met een verbindingsgebied tussen elke diamant van 20 μm. Kanaaltypen worden gedupliceerd, schaalbalken = 1 mm. (F) Interactiezone tussen twee naderende hyphale fronten, groeiend uit tegenovergestelde uiteinden van het onderling verbonden interactiekanaal. Fasecontrastmicroscopiebeeld, schaalbalk = 250 μm. De panelen in deze figuur zijn aangepast van Stanley et al., 2014 (A-C)40 en Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Filamenteuze schimmels zijn succesvolle bewoners van de bodem en spelen een belangrijke rol in bodemecosystemen, zoals bij de afbraak van organische en anorganische stoffen, evenals de regulering van nutriëntenniveaus. Daar vinden ze ook tal van mogelijkheden om te communiceren met een verscheidenheid aan andere microben zoals bacteriën of andere schimmels. Het bestuderen van schimmelinteracties op cellulair niveau kan echter een uitdaging zijn vanwege de black box-achtige aard van de bodem. Nieuwe microfluïdische hulpmiddelen worden ontwikkeld voor de studie van schimmelinteracties; twee platforms die zijn ontworpen om bacteriële-schimmel- en schimmel-schimmelinteracties te bestuderen, worden benadrukt. Binnen deze microkanalen kunnen schimmel-microbiële interacties worden gemonitord in gecontroleerde fysisch-chemische omgevingen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie dan voorheen mogelijk was. Toepassing van deze hulpmiddelen heeft tal van nieuwe biologische inzichten opgeleverd, zoals de observatie van bacteriële polaire aanhechting aan schimmeldraden of het onthullen van niet-gekarakteriseerde schimmel-schimmelantagonismen. Een belangrijk kenmerk van deze methodologieën betreft het gebruiksgemak van deze tool door niet-experts, wat zeer vertaalbare technologieën oplevert voor gebruik in microbiologische laboratoria.

Representatieve resultaten worden gepresenteerd van de voorbeeldige BFI40- en FFI41-apparaten. Hyphal groeisnelheidsmetingen kunnen eenvoudig worden verkregen met behulp van deze apparaten in combinatie met basismicroscopietechnieken. Figuur 3A-B illustreert bacteriële-schimmelinteracties tussen C. cinerea-schimmeldraden en B. subtilis NCIB 3610. De aanwezigheid van B. subtilis stopt...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Met behulp van de gepresenteerde microfluïdische apparaten kunnen we dynamische interacties tussen schimmels en andere microben onderzoeken met nauwkeurige ruimtelijke en omgevingscontrole, evenals beeldvorming met hoge resolutie op het niveau van één cel. Belangrijk is dat schimmelgroei kan worden beperkt en gericht binnen het microfluïdische kanaal. Hiermee kunnen time-lapse-afbeeldingen van hoge kwaliteit worden verkregen.Daarom kunnen de complexiteiten van schimmel-schimmel- en schimmel-bacteriële interacties worden onderzocht. Het begrijpen van microbiële interacties van schimmels is een essentiële stap in het definiëren en behouden van het bodemmicrobioom. Deze kennis kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe biocontrolemiddelen met duurzame landbouw.Bereid om te beginnen ongeveer 40 gram poly (dimethylsiloxaan) of PDM's, door de basis en het uithardingsmiddel grondig te mengen in een verhouding van 10 tot 1 met behulp van een spatel in een schone plastic beker. Om alle luchtbellen te verwijderen, plaatst u de beker gedurende een uur in een vacuümkamer. Bevestig vervolgens met behulp van doorzichtige tape de hoofdmal in een plastic houder en gebruik gecomprimeerde gefilterde lucht om stofdeeltjes te verwijderen, giet vervolgens de PDM's op het midden van de hoofdmal en laat deze bezinken.Om te voorkomen dat stofdeeltjes op het PDM-oppervlak bezinken, bedekt u de hoofdmal losjes met een plastic deksel, brengt u de hoofdmal over naar een oven en hardt u 's nachts uit bij 70 graden Celsius. Nadat u de hoofdmal uit de oven hebt gehaald en deze hebt laten afkoelen, verwijdert u de uitgeharde PDM's van de hoofdmal en het plastic frame zonder de hoofdmal in de PDM's te beschadigen. Om vervolgens een stofvrij oppervlak te behouden, plaatst u doorzichtige tape over de microkanalen die in reliëf in de PDM's zijn aangebracht.Gebruik vervolgens een gemonteerde guillotine of een scheermesje om de PDM's in platen te snijden zoals aangegeven door het ontwerp. Wanneer u de laterale opening van de PDM-plaat snijdt die wordt gebruikt voor het bacterie-schimmelinteractieapparaat of BFI-apparaat, moet u ervoor zorgen dat de microkanalen volledig open zijn. Voor PDM-platen die worden gebruikt bij de assemblage van het schimmel-schimmelinteractieapparaat of FFI, moet elke hoek echter worden bijgesneden zodat deze in een petrischaal met glazen bodem past.Gebruik vervolgens een precisiesnijder om inlaat- of uitlaatgaten te ponsen volgens het ontwerp van het apparaat. Dompel vervolgens de PDM-platen onder in een 0,5 molaire natriumhydroxideoplossing. Spoel de platen af in steriel dubbel gedestilleerd water voordat u ze overbrengt in een 70% ethanoloplossing.Nadat u de ethanol hebt verwijderd en de platen opnieuw hebt gespoeld met dubbel gedestilleerd steriel water, dompelt u de platen onder in steriel dubbel gedestilleerd water en soniceert u gedurende vijf minuten, verwijdert u vervolgens de PDM-plaat uit het water, droogt u ze met gecomprimeerde gefilterde lucht en plaatst u ze in een steriele vierkante petrischaal. Incubeer vervolgens de petrischaal met PDM's in een oven op 70 graden Celsius gedurende een uur. Zodra de platen zijn afgekoeld in een stofvrije omgeving, verwijdert u stof van hun oppervlak met behulp van tape en perslucht.Om de oppervlakken van de PDM-platen en petrischalen met glazen bodem te activeren, die vervolgens aan elkaar worden gebonden, plaatst u ze in een plasmareiniger met de te activeren oppervlakken naar boven gericht. Nadat u de PDM-plaat in de petrischalen uit de plasmareiniger hebt verwijderd, hecht u ze voorzichtig door de geactiveerde oppervlakken in hoekgetrouw contact met elkaar te plaatsen. Verlijm BFI- en FFI PDM-platen met petrischalen van respectievelijk 35 millimeter en 55 millimeter diameters, voor het controleren van de succesvolle verlijming, probeer het PDM-lab met een pincet van zijn petrischaal te trekken.Visualiseer het apparaat zorgvuldig met het oog of door generieke microscopie om ervoor te zorgen dat de inentingsinlaten of microkanalen niet instorten. Voor waterverzadigde of voedselrijke omstandigheden pipet u 100 microliter van de gewenste oplossing om BFI-apparaten onmiddellijk na het verlijmen te vullen. Voeg voor FFI-apparaten 30 microliter van het medium toe aan elke inlaat.Voeg ten slotte 100 tot 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de petrischaal om de luchtvochtigheid op peil te houden. Voor onverzadigde wateromstandigheden voegt u echter gewoon 100 tot 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de petrischaal om de luchtvochtigheid te handhaven. Voor schimmelinenting, in een laminaire stromingskap, met behulp van een gesteriliseerde kurkboorder, verwijder een agarplug uit een kolonie aan de rand van een drie dagen oude cultuur, om ervoor te zorgen dat het groeiende hyphal-front intact blijft.Breng vervolgens de agarplug in de schimmelinlaat van het BFI- en / of FFI-apparaat met de myceliumzijde naar beneden in de hyphal-voorkant gericht op de microkanaalopeningen om hyphale infiltratie van de kanalen aan te moedigen. Voor het FFI-apparaat, introduceer een andere agarplug met een tweede schimmelsoort in de tegenovergestelde inlaat. Sluit vervolgens de petrischaal af met een transparante film en incubeer bij 25 tot 28 graden Celsius in het donker totdat u in beeld wordt gebracht.Voor bacteriële inenting, na het verwijderen van het BFI-apparaat uit de incubator, pipet u 10 microliter van een bacteriële suspensie in de bacteriële inlaat in een steriele omgeving. Zodra de petrischaal is verzegeld met een transparante film, bewaart u het apparaat rechtop bij 25 graden Celsius in het donker totdat de beeldvorming begint. Met behulp van dit protocol kon de interactie tussen de schimmel Coprinopsis cinerea en de bacterie Bacillus subtilis met succes worden gevisualiseerd.Er werd waargenomen dat in aanwezigheid van de bacterie de groeisnelheid van de schimmel drastisch begon af te nemen na ongeveer vijf uur co-inenting. Bovendien hadden de schimmeldraden geassocieerd met de bacteriën een dun en transparant uiterlijk. Timelapse fluorescentiemicroscopie onthulde ook schimmeldraden collaps na vijf uur co-collulatie met Bacillus subtilis.Vanaf zes uur begon echter ook de bacteriepopulatie af te nemen. Visualisatie van schimmel-schimmelinteracties toonde aan dat Fusarium graminearum de groei van Trichoderma rossicum sterk remde, wat duidelijk was met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol onthulde verder significante morfologische veranderingen in de schimmel Verticillium longisporum in de aanwezigheid van bacteriën Pseudomonas synxantha en Pseudomonas fluorescens.De hoge resolutie dynamische beeldvormingstechniek die in de studie werd gebruikt, onthulde ook septavorming in Fusarium graminearum in aanwezigheid van de schimmel Clonostachys rosea. Fluorescentielabeling bood de dynamische kwantificering van Clonostachys rosea hyphal proliferatie in het FFI-apparaat. Deze apparaten kunnen door de gebruiker worden aangepast en aangepast om verschillende soorten van belang op te nemen en hun specifieke experimentele vragen over microbiële interacties van schimmels aan te pakken.Zowel de BFI- als de FFI-apparaten hebben wetenschappelijke grenzen verlegd en onthulden hoe schimmels verdedigingssignalen en voedingsstoffen verspreiden bij aanvallen door schimmels, virussen, nematoden en onderzoeken naar bacteriële verspreiding mogelijk maken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Een Microfluïdische-gebaseerde Hydrodynamische Trap voor Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-stap Variabele Hoogte fotolithografie voor Valved Multilayer microfluïdische apparaten

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...