Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
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Nous reconnaissons le soutien financier du département de bio-ingénierie de l’Imperial College de Londres et du Leverhulme Trust (référence de subvention de recherche: RPG-2020-352).

REMARQUE : Un résumé des procédures décrites dans ce protocole est illustré visuellement à la figure 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figure 2 : Représentation schématique de la méthodologie présentée, composée de cinq grandes sections détaillées dans le présent protocole. Les conceptions d’appareils sont...

Cet article présente un protocole pour l’étude des interactions fongiques-microbiennes à l’aide de la microfluidique des canaux. Les auteurs visent à démontrer la polyvalence de ces dispositifs et à encourager l’adaptation en fonction des intérêts du chercheur. En utilisant les dispositifs BFI et FFI exemplaires, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être étudiées plus en détail qu’auparavant. En supprimant la complexité et l’hétérogénéité du fond du sol, en modérant la croissance d...

Le sol est un environnement exceptionnellement diversifié contenant une abondance de micro-organismes qui jouent un rôle déterminant dans les cyclesdu carbone et du phosphore 1,2. Les champignons filamenteux sont une composante majeure de nombreux écosystèmes en tant que décomposeurs de matière organique et inorganique et peuvent améliorer la nutrition des plantes grâce à la formation de relations symbiotiques 3,4. Dans le sol, les champignons interagissent dynamiquement avec une multitude de microbes tels que d’autres champignons5, bactéries6, virus7 et nématodes8. Ces interactions ont des conséquences importantes sur la santé des sols et des plantes. Pourtant, en raison d’un manque de systèmes expérimentaux appropriés capables d’imager les micro-organismes en interaction avec une haute résolution, beaucoup restent indéfinis.
Les recherches concernant les interactions bactériens-fongiques (IFI) et les interactions fongiques-fongiques (IFF) ont des applications précieuses dans divers domaines, y compris les antimicrobiens en médecine et les agents de lutte biologique en agriculture. Par exemple, le champignon Coprinopsis cinerea produit le peptide copsine, dont il a été démontré qu’il présente une activité antibactérienne contre l’agent pathogène humain Listeria monocytogenes9. De même, le composé dérivé du champignon, la griséofulvine, est largement utilisé comme traitement des infections fongiques humaines et est en outre capable d’inhiber la croissance du champignon phytopathogène Alternaria solani10,11. Il a également été démontré que plusieurs souches de la bactérie bacillus subtilis sont des agents de lutte biologique efficaces de l’agent pathogène fongique des plantes Rhizoctonia solani12,13. Néanmoins, en raison des limites associées aux méthodologies traditionnelles, les IFI et les IFF sont mal compris au niveau des cellules individuelles.
Les études conventionnelles explorent généralement les IFI et les IFF à l’échelle macro en utilisant des plaques de gélose avec deux espèces ou plus en confrontation. Leur interaction est évaluée en mesurant les taux de croissance et la production de métabolites de l’espèce confrontante 14,15,16; cependant, cette méthodologie n’est résolue qu’au niveau de la colonie. Pour étudier les interactions au niveau cellulaire, les inoculants bactériens et fongiques peuvent être cultivés sur des lames de microscope en verre recouvertes d’agar qui sont ensuite imagées au microscope17. Néanmoins, il peut être difficile de suivre un seul hyphe à l’aide de lames de microscope en raison d’un manque de confinement, ce qui signifie que les images time-lapse sont plus difficiles à obtenir. En outre, la possibilité de confiner spatialement d’autres micro-organismes dans des régions définies du mycélium fongique ou de créer des environnements chimiques définis qui peuvent être perturbés, par exemple, n’est pas possible dans de telles configurations. La nature « boîte noire » du sol ajoute également à la complexité de l’étude des interactions fongiques-microbiennes au niveau des cellules individuelles18. En observant les espèces en interaction loin de l’incroyable diversité du microbiome du sol, la manière exacte dont les membres individuels interagissent peut être évaluée. Ainsi, il existe un besoin continu de plates-formes polyvalentes qui permettent l’imagerie unicellulaire à haute résolution des IFI et des IFF.
Les technologies microfluidiques, appelées systèmes de laboratoire sur puce, constituent une plate-forme idéale pour l’étude des BFI et des IFF au niveau des cellules individuelles. Le domaine de la microfluidique, issu des technologies développées pour l’analyse chimique et la microélectronique, a été adopté par les sciences biologiques19. Les technologies microfluidiques régulent de petits volumes de fluides au sein d’un réseau sur mesure de canaux miniaturisés, ayant au moins une dimension à l’échelle micrométrique, et leur utilisation dans la recherche biologique s’étend20. En particulier, des dispositifs microfluidiques ont été développés pour examiner la croissance des champignons filamenteux 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. L’un des avantages de l’utilisation de cette technologie est que le confinement des hyphes et la distribution des nutriments dans les microcanaux ressemblent davantage à la structure de l’environnement du sol que les méthodes conventionnelles d’agar31. Récemment, des plateformes microfluidiques ont été utilisées pour étudier les interactions entre les neutrophiles humains et les agents pathogènes fongiques32, les bactéries et les racines des plantes33, ainsi que les champignons et les nématodes34,35.
L’un des nombreux avantages de l’utilisation de la microfluidique pour étudier les interactions microbiennes comprend le contrôle spécifique de l’environnement des microcanaux. Par exemple, les régimes d’écoulement laminaire peuvent être exploités pour générer des gradients de concentration définis, ce qui est particulièrement utile lors de l’examen de la chimiotaxie bactérienne36. Un autre avantage est que la nature transparente du poly(diméthylsiloxane) (PDMS), un polymère élastomère biocompatible peu coûteux couramment utilisé dans la fabrication de dispositifs microfluidiques, facilite l’imagerie à haute résolution de cellules individuelles à l’aide de la microscopie à fond clair et à fluorescence37. De même, le confinement des microbes dans des microcanaux signifie que des expériences en accéléré de suivi de cellules individuelles peuvent être effectuées, permettant d’enregistrer et de quantifier les réponses cellulaires individuelles37. Enfin, comme les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour être conviviaux, ils peuvent être facilement utilisés par des non-experts38.
Il est important de mieux connaître les interactions entre les micro-organismes vivant dans le sol pour améliorer les pratiques de gestion durable des écosystèmes qui maintiennent la biodiversité et atténuer l’impact des changements climatiques sur les environnements terrestres39. Ainsi, le développement de nouveaux outils microfluidiques est fondamental pour élargir la compréhension des champignons et de leurs interactions au niveau cellulaire. Le protocole ici se concentrera sur deux dispositifs microfluidiques produits pour l’étude des BFI40 et41 tels que représentés à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation visuelle et schématique des dispositifs d’interaction bactérienne-fongique (BFI) et d’interaction fongique (FFI). (A) Image du dispositif BFI. Un bouchon mycélien est placé à l’entrée d’une extrémité des microcanaux pour permettre la croissance hyphale dans l’appareil. L’entrée bactérienne se trouve à l’extrémité opposée. Barre d’échelle = 5 mm. (B) Vue d’ensemble schématique du dispositif BFI, décrivant le positionnement des entrées bactériennes et la direction de la croissance hyphale à travers les microcanaux d’interaction. Les canaux ont une profondeur de 10 μm, une largeur de 100 μm et une longueur de 7 mm, avec 28 canaux d’observation au total. (C) Essai de confrontation sur plaque de gélose entre Coprinopsis cinerea et Bacillus subtilis NCIB 3610, barre d’échelle = 20 mm (à gauche). Images microscopiques montrant l’interaction entre C. cinerea et B. subtilis NCIB 3610 dans le microcanal (milieu et droite), c’est-à-dire la fixation polaire des bactéries aux hyphes fongiques. Barre d’échelle = 25 μm (au milieu) et 10 μm (à droite). (D) Image du dispositif FFI collé à une boîte de Petri à fond de verre, double inoculée avec des bouchons mycéliens. Barre d’échelle = 1 cm. (E) Vue d’ensemble schématique du périphérique FFI. Deux bouchons d’inoculant fongiques sont introduits dans les entrées à chaque extrémité de l’appareil, permettant l’exploration hyphale des microcanaux. Les canaux de contrôle sont connectés à une seule entrée fongique et ont un canal sans issue, empêchant les interactions entre les champignons d’essai. Les canaux d’interaction relient les deux entrées fongiques et permettent des interactions hyphales entre les sujets testés au sein du microcanal. Chaque canal d’interaction se compose de 18 sections en forme de diamant, mesurant une longueur totale de 8,8 mm (490 x 430 μm par diamant), 10 μm de profondeur et ayant une région de connexion entre chaque diamant de 20 μm. Les types de canaux sont dupliqués, barres d’échelle = 1 mm. (F) Zone d’interaction entre deux fronts hyphales approchants, se développant à partir des extrémités opposées du canal d’interaction interconnecté. Image de microscopie à contraste de phase, barre d’échelle = 250 μm. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 et Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Les champignons filamenteux sont des habitants prospères du sol et jouent un rôle majeur dans les écosystèmes du sol, tels que la décomposition de la matière organique et inorganique, ainsi que la régulation des niveaux de nutriments. Ils y trouvent également de nombreuses occasions d’interagir avec une variété d’autres microbes tels que des bactéries ou d’autres champignons. L’étude des interactions fongiques au niveau cellulaire, cependant, peut être difficile en raison de la nature du sol ressemblant à une boîte noire. De nouveaux outils microfluidiques sont en cours de développement pour l’étude des interactions fongiques; deux plateformes conçues pour étudier les interactions bactérien-fongique et fongique-fongique sont mises en évidence. Au sein de ces microcanaux, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être surveillées dans des environnements physico-chimiques contrôlés à une résolution temporelle et spatiale plus élevée qu’auparavant. L’application de ces outils a donné lieu à de nombreuses nouvelles connaissances biologiques, telles que l’observation de l’attachement polaire bactérien aux hyphes ou la révélation d’antagonismes fongiques-fongiques non caractérisés. Une caractéristique clé de ces méthodologies concerne la facilité d’utilisation de cet outil par des non-experts, produisant des technologies hautement traduisibles pour une utilisation dans les laboratoires de microbiologie.

Des résultats représentatifs sont présentés à partir des dispositifs exemplaires BFI40 et FFI41. Les mesures du taux de croissance de l’hyphalie peuvent facilement être obtenues à l’aide de ces dispositifs en combinaison avec des techniques de microscopie de base. La figure 3A-B illustre les interactions bactériens-fongiques entre C. cinerea hyphae et B. subtilis NCIB 3610. La pré...

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Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

À l’aide des dispositifs microfluidiques présentés, nous pouvons examiner les interactions dynamiques entre les champignons et d’autres microbes avec un contrôle précis de l’espace et de l’environnement, ainsi qu’une imagerie à haute résolution au niveau de la cellule unique. Il est important de noter que la croissance fongique peut être confinée et dirigée dans le canal microfluidique. Permettant d’obtenir des images en accéléré de haute qualité.Par conséquent, les complexités des interactions fongiques-fongiques et fongiques-bactériennes peuvent être explorées. Comprendre les interactions microbiennes fongiques est une étape essentielle dans la définition et la préservation du microbiome du sol. Ces connaissances peuvent être exploitées pour le développement de nouveaux agents de lutte biologique avec une agriculture durable.Pour commencer, préparez environ 40 grammes de poly(diméthylsiloxane) ou de PDM, en mélangeant soigneusement la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 à 1 à l’aide d’une spatule dans un gobelet en plastique propre. Pour éliminer toutes les bulles d’air, placez la tasse dans une chambre à vide pendant une heure. Ensuite, à l’aide de ruban adhésif transparent, fixez le moule principal dans un support en plastique et utilisez de l’air filtré comprimé pour éliminer les particules de poussière, puis versez les PDM sur le centre du moule maître et laissez-le se déposer.Pour éviter la sédimentation des particules de poussière sur la surface des PDM, recouvrez lâchement le moule maître avec un couvercle en plastique, puis transférez le moule maître dans un four et durcissez pendant la nuit à 70 degrés Celsius. Après avoir retiré le moule maître du four et l’avoir laissé refroidir, retirez les PDM durcis du moule principal et du cadre en plastique sans endommager le moule maître dans les PDM. Ensuite, pour maintenir une surface sans poussière, placez du ruban adhésif transparent sur les microcanaux en relief dans les PDM.Ensuite, utilisez une guillotine montée ou une lame de rasoir pour couper les PDM en dalles comme indiqué par la conception. Lors de la coupe de l’ouverture latérale de la dalle PDM utilisée pour le dispositif d’interaction bactérien-fongique, ou dispositif BFI, assurez-vous que les microcanaux sont complètement ouverts. Cependant, pour les dalles PDM utilisées dans l’assemblage du dispositif d’interaction fongique-fongique, ou FFI, chaque coin doit être coupé de manière à ce qu’il s’insère dans une boîte de Petri à fond de verre.Ensuite, utilisez une fraise de précision pour percer les trous d’entrée ou de sortie en fonction de la conception de l’appareil. Ensuite, immergez les dalles de PDM dans une solution d’hydroxyde de sodium de 0,5 molaire. Rincez les brames dans de l’eau stérile à double distillation avant de les transférer dans une solution d’éthanol à 70%.Après avoir retiré l’éthanol et rincé à nouveau les brames avec de l’eau stérile double distillée, immergez les dalles dans de l’eau stérile double distillée et soniquez pendant cinq minutes, puis retirez la dalle de PDM de l’eau, séchez-les avec de l’air filtré comprimé et placez-les dans une boîte de Petri carrée stérile. Ensuite, incubez la boîte de Petri avec une dalle PDM dans un four à 70 degrés Celsius pendant une heure. Une fois que les dalles ont refroidi dans un environnement sans poussière, éliminez toute poussière de leur surface à l’aide de ruban adhésif et d’air filtré comprimé.Pour activer les surfaces des dalles PDM et des boîtes de Petri à fond de verre, qui seront ensuite collées ensemble, placez-les dans un nettoyeur plasma avec les surfaces à activer vers le haut. Après avoir retiré la dalle des PDM dans les boîtes de Petri du nettoyeur plasma, collez-les doucement en plaçant les surfaces activées en contact conforme les unes avec les autres. Bond BFI et FFI PDMs dalle avec des boîtes de Petri de 35 millimètres et 55 millimètres de diamètres, respectivement pour vérifier le collage réussi, essayez de retirer le laboratoire PDM de sa boîte de Petri avec une pince à épiler.Visualisez soigneusement l’appareil à l’œil nu ou par microscopie générique pour éviter l’effondrement des entrées d’inoculation ou des microcanaux. Pour les conditions saturées en eau ou riches en nutriments, pipettez 100 microlitres de la solution souhaitée pour remplir les dispositifs BFI immédiatement après le collage. Pour les appareils FFI, ajoutez 30 microlitres du support dans chaque entrée.Enfin, ajoutez 100 à 200 microlitres d’eau stérile double distillée à la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité. Cependant, pour les conditions d’eau insaturée, il suffit d’ajouter 100 à 200 microlitres d’eau stérile double distillée à la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité. Pour l’inoculation fongique, à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire, à l’aide d’un foreur de liège stérilisé, retirez un bouchon de gélose d’une colonie à la périphérie d’une culture vieille de trois jours, en veillant à garder intact le front hyphale en croissance.Introduisez ensuite le bouchon de gélose dans l’entrée fongique du dispositif BFI et / ou FFI avec le côté mycélium vers le bas dans le front hyphale orienté vers les ouvertures microcanaux pour encourager l’infiltration hyphale des canaux. Pour l’appareil FFI, introduisez un autre bouchon de gélose avec une deuxième espèce fongique dans l’entrée opposée. Ensuite, scellez la boîte de Petri avec un film transparent et incubez à 25 à 28 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.Pour l’inoculation bactérienne, après avoir retiré le dispositif BFI de l’incubateur, pipettez 10 microlitres d’une suspension bactérienne dans l’entrée bactérienne dans un environnement stérile. Une fois la boîte de Petri scellée avec un film transparent, rangez l’appareil à la verticale à 25 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce que l’imagerie commence. En utilisant ce protocole, l’interaction entre le champignon Coprinopsis cinerea et la bactérie Bacillus subtilis a pu être visualisée avec succès.Il a été observé qu’en présence de la bactérie, le taux de croissance du champignon a commencé à diminuer considérablement après environ cinq heures de coinoculation. De plus, les hyphes fongiques associés à la bactérie avaient un aspect mince et transparent. La microscopie à fluorescence en accéléré a également révélé un effondrement des hyphes fongiques après cinq heures de coinoculation avec Bacillus subtilis.Cependant, à partir de six heures, la population bactérienne a également commencé à décliner. La visualisation des interactions fongiques-fongiques a montré que Fusarium graminearum inhibait fortement la croissance de Trichoderma rossicum, ce qui était évident en utilisant la microscopie à fluorescence. Ce protocole a en outre révélé des changements morphologiques significatifs dans le champignon Verticillium longisporum en présence des bactéries Pseudomonas synxantha et Pseudomonas fluorescens.La technique d’imagerie dynamique à haute résolution utilisée dans l’étude a également révélé la formation de septa dans Fusarium graminearum en présence du champignon Clonostachys rosea. Le marquage par fluorescence a permis la quantification dynamique de la prolifération hyphale de Clonostachys rosea dans le dispositif FFI. Ces dispositifs peuvent être adaptés et modifiés par l’utilisateur pour incorporer différentes espèces d’intérêt et répondre à leurs questions expérimentales spécifiques concernant les interactions microbiennes fongiques.Les dispositifs BFI et FFI ont repoussé les frontières scientifiques, révélant comment les champignons propagent les signaux de défense et les nutriments lors d’attaques de champignons, de virus, de nématodes et permettant des recherches sur la dispersion bactérienne.

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JoVE Journal

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