Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Wir danken der finanziellen Unterstützung des Department of Bioengineering am Imperial College London und des Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

HINWEIS: Eine Zusammenfassung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 2 visuell dargestellt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der vorgestellten Methodik, bestehend aus fünf Hauptabschnitten, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind. Gerätedesigns we...

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen unter Verwendung der Kanalmikrofluidik vor. Ziel der Autoren ist es, die Vielseitigkeit dieser Geräte zu demonstrieren und die Anpassung an die Interessen des Forschers zu fördern. Mit Hilfe der beispielhaften BFI- und FFI-Geräte können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen detaillierter untersucht werden, als bisher zugänglich. Durch die Beseitigung der Hintergrundkomplexität und Heterogenität des Bodens, die Moderation de...

Der Boden ist eine außergewöhnlich vielfältige Umgebung, die eine Fülle von Mikroorganismen enthält, die für Kohlenstoff- und Phosphorzyklen von entscheidender Bedeutung sind 1,2. Filamentöse Pilze sind ein wichtiger Bestandteil zahlreicher Ökosysteme als Zersetzer von organischer und anorganischer Substanz und können die Ernährung von Pflanzen durch die Bildung symbiotischer Beziehungenverbessern 3,4. Im Boden interagieren Pilze dynamisch mit einer Vielzahl von Mikroben wie anderen Pilzen5, Bakterien 6, Viren7 und Nematoden8. Diese Wechselwirkungen haben erhebliche Folgen für die Boden- und Pflanzengesundheit. Aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Systemen, die in der Lage sind, interagierende Mikroorganismen mit hoher Auflösung abzubilden, bleiben viele jedoch undefiniert.
Untersuchungen zu bakteriell-pilzlichen Interaktionen (BFIs) und Pilz-Pilz-Interaktionen (FFIs) haben wertvolle Anwendungen in einer Reihe von Bereichen, darunter antimikrobielle Mittel in der Medizin und biologische Bekämpfungsmittel in der Landwirtschaft. Zum Beispiel produziert der Pilz Coprinopsis cinerea das Peptid Copsin, das nachweislich eine antibakterielle Aktivität gegen den menschlichen Erreger Listeria monocytogenes9 aufweist. Ebenso wird die pilzliche Verbindung Griseofulvin häufig zur Behandlung von menschlichen Pilzinfektionen eingesetzt und ist zusätzlich in der Lage, das Wachstum des pflanzenpathogenen Pilzes Alternaria solani10,11 zu hemmen. Mehrere Stämme des bodenbewohnenden Bakteriums Bacillus subtilis haben sich ebenfalls als wirksame Biokontrollmittel des pilzlichen Pflanzenpathogens Rhizoctonia solani12,13 erwiesen. Aufgrund von Einschränkungen, die mit traditionellen Methoden verbunden sind, werden BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen jedoch nur unzureichend verstanden.
Konventionelle Studien untersuchen typischerweise BFIs und FFIs auf der Makroskala unter Verwendung von Agarplatten mit zwei oder mehr Arten in Konfrontation. Ihre Wechselwirkung wird durch Messung der Wachstumsraten und der Metabolitenproduktion der konfrontierenden Spezies14,15,16 bewertet; Diese Methodik wird jedoch nur auf Kolonieebene gelöst. Um Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, können bakterielle und pilzliche Impfmittel auf mit Agar beschichteten Glasmikroskopobjektträgern kultiviert werden, die dann unter einem Mikroskopabgebildet werden 17. Dennoch kann es schwierig sein, einem einzelnen Hypha mit Objektträgern zu folgen, da es an Enge mangelt, was bedeutet, dass Zeitrafferbilder schwieriger zu erhalten sind. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, andere Mikroorganismen räumlich in definierten Regionen des Pilzmyzels einzuschließen oder definierte chemische Umgebungen zu schaffen, die beispielsweise gestört werden können, in solchen Aufbauten nicht möglich. Die "Black Box" -Natur des Bodens trägt auch zur Komplexität der Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Interaktionen auf der Ebene einzelner Zellenbei 18. Durch die Beobachtung interagierender Arten abseits der unglaublichen Vielfalt des Bodenmikrobioms kann die genaue Art und Weise, wie einzelne Mitglieder interagieren, beurteilt werden. Daher besteht weiterhin Bedarf an vielseitigen Plattformen, die eine hochauflösende Einzelzellbildgebung von BFIs und FFIs ermöglichen.
Mikrofluidische Technologien, sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung von BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen. Der Bereich der Mikrofluidik, der aus Technologien stammt, die für die chemische Analyse und Mikroelektronik entwickelt wurden, wurde von den Biowissenschaftenübernommen 19. Mikrofluidische Technologien regulieren kleine Mengen von Flüssigkeiten innerhalb eines maßgeschneiderten Netzwerks miniaturisierter Kanäle, die mindestens eine Dimension auf der Mikrometerskala haben, und ihre Verwendung in der biologischen Forschung nimmt zu20. Insbesondere wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um das Wachstum von fadenförmigen Pilzen 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 zu untersuchen. Ein Vorteil der Verwendung dieser Technologie besteht darin, dass der Einschluss von Hyphen und die Verteilung von Nährstoffen innerhalb von Mikrokanälen der Struktur der Bodenumgebung ähnlicher ist als herkömmliche Agarmethoden31. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Plattformen verwendet, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und pilzlichen Krankheitserregern 32, Bakterien und Pflanzenwurzeln33 sowie Pilzen und Nematoden34,35 zu untersuchen.
Einer der vielen Vorteile der Verwendung von Mikrofluidik zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist die spezifische Steuerung der Mikrokanalumgebung. Zum Beispiel können laminare Strömungsregime genutzt werden, um definierte Konzentrationsgradienten zu erzeugen, was besonders bei der Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis36 nützlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die transparente Natur von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), einem kostengünstigen, biokompatiblen Elastomerpolymer, das üblicherweise bei der Herstellung von mikrofluidischen Bauelementen verwendet wird, die hochauflösende Bildgebung einzelner Zellen mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopieermöglicht 37. Ebenso bedeutet der Einschluss von Mikroben in Mikrokanälen, dass Zeitrafferexperimente, die einzelne Zellen verfolgen, durchgeführt werden können, so dass einzelne zelluläre Reaktionen aufgezeichnet und quantifiziert werdenkönnen 37. Da mikrofluidische Geräte benutzerfreundlich gestaltet werden können, können sie von Nicht-Experten leicht eingesetzt werden38.
Die Förderung des Wissens über die Wechselwirkungen zwischen bodenbewohnenden Mikroorganismen ist wichtig, um nachhaltige Ökosystembewirtschaftungspraktiken zu verbessern, die die biologische Vielfalt erhalten und die Auswirkungen des Klimawandels auf die terrestrische Umwelt mildern39. Daher ist die Entwicklung neuartiger mikrofluidischer Werkzeuge von grundlegender Bedeutung, um das Verständnis von Pilzen und ihren Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu erweitern. Das Protokoll konzentriert sich hier auf zwei mikrofluidische Geräte, die für die Untersuchung der BFIs40 und FFIs41 hergestellt wurden, wie in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Abbildung 1: Visuelle und schematische Darstellung der Geräte für die bakterielle-pilzische Interaktion (BFI) und die Pilz-Pilz-Interaktion (FFI). (A) Bild des BFI-Geräts. Ein Myzelstopfen wird am Eingang zu einem Ende der Mikrokanäle platziert, um das Wachstum der Hyphen in das Gerät zu ermöglichen. Der bakterielle Einlass befindet sich am gegenüberliegenden Ende. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) Schematische Übersicht des BFI-Geräts, das die Positionierung der bakteriellen Einlässe und die Richtung des Hyphenwachstums durch die Interaktionsmikrokanäle darstellt. Die Kanäle sind 10 μm tief, 100 μm breit und 7 mm lang, mit insgesamt 28 Beobachtungskanälen. (C) Konfrontationstest auf Agarplatte zwischen Coprinopsis cinerea und Bacillus subtilis NCIB 3610, Skalenstab = 20 mm (links). Mikroskopische Aufnahmen, die die Wechselwirkung zwischen C. cinerea und B. subtilis NCIB 3610 innerhalb des Mikrokanals (Mitte und rechts) zeigen, d.h. die polare Anheftung von Bakterien an Pilzhyphen. Skalenbalken = 25 μm (Mitte) und 10 μm (rechts). (D) Abbildung des FFI-Geräts, das an eine Petrischale mit Glasboden gebunden ist, die mit Myzelstopfen doppelt beimpft ist. Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Schematische Übersicht des FFI-Geräts. Zwei Pilzimpfstopfen werden an beiden Enden des Geräts in die Einlässe eingeführt, was eine hyphalische Exploration der Mikrokanäle ermöglicht. Die Steuerkanäle sind nur mit einem Pilzeinlass verbunden und haben einen Sackgassenkanal, der Wechselwirkungen zwischen den Testpilzen verhindert. Interaktionskanäle verbinden beide Pilzeinlässe und ermöglichen hyphalische Interaktionen zwischen den Probanden innerhalb des Mikrokanals. Jeder Interaktionskanal besteht aus 18 rautenförmigen Abschnitten, die eine Gesamtlänge von 8,8 mm (490 x 430 μm pro Diamant), 10 μm tief und einen Verbindungsbereich zwischen jedem Diamanten von 20 μm messen. Kanaltypen werden dupliziert, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Interaktionszone zwischen zwei sich nähernden Hyphenfronten, die von gegenüberliegenden Enden des miteinander verbundenen Interaktionskanals wächst. Phasenkontrastmikroskopie-Bild, Maßstabsbalken = 250 μm. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A-C)40 und Gimeno et al., 2021 (D-F)41 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Filamentöse Pilze sind erfolgreiche Bewohner des Bodens und spielen eine wichtige Rolle in Bodenökosystemen, etwa beim Abbau organischer und anorganischer Stoffe, sowie bei der Regulierung des Nährstoffgehalts. Dort finden sie auch zahlreiche Möglichkeiten, mit einer Vielzahl anderer Mikroben wie Bakterien oder anderen Pilzen zu interagieren. Die Untersuchung von Pilzinteraktionen auf zellulärer Ebene kann jedoch aufgrund der Black-Box-ähnlichen Natur des Bodens eine Herausforderung darstellen. Neue mikrofluidische Werkzeuge werden für die Untersuchung von Pilzinteraktionen entwickelt; Zwei Plattformen zur Untersuchung von bakteriell-pilzlichen und Pilz-Pilz-Interaktionen werden hervorgehoben. Innerhalb dieser Mikrokanäle können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen in kontrollierten physikalisch-chemischen Umgebungen mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung als bisher beobachtet werden. Die Anwendung dieser Werkzeuge hat zahlreiche neue biologische Erkenntnisse hervorgebracht, wie z.B. die Beobachtung der bakteriellen polaren Bindung an Hyphen oder die Aufdeckung uncharakterisierter Pilz-Pilz-Antagonismen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methoden ist die einfache Verwendung dieses Tools durch Nicht-Experten, was zu hochgradig übersetzbaren Technologien für den Einsatz in mikrobiologischen Labors führt.

Repräsentative Ergebnisse werden anhand der Exemplare BFI40 und FFI41 vorgestellt. Hyphenwachstumsratenmessungen können mit diesen Geräten in Kombination mit grundlegenden Mikroskopietechniken leicht durchgeführt werden. Abbildung 3A-B veranschaulicht bakteriell-pilzliche Interaktionen zwischen C. cinerea hyphae und B. subtilis NCIB 3610. Das Vorhandensein von B. subtilis stoppt d...

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Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Mit den vorgestellten mikrofluidischen Geräten können wir dynamische Wechselwirkungen zwischen Pilzen und anderen Mikroben mit präziser räumlicher und Umgebungskontrolle sowie hochauflösender Bildgebung auf Einzelzellebene untersuchen. Wichtig ist, dass das Pilzwachstum innerhalb des mikrofluidischen Kanals begrenzt und gelenkt werden kann. Ermöglicht qualitativ hochwertige Zeitrafferbilder.Daher kann die Komplexität von Pilz-Pilz- und Pilz-Bakterien-Interaktionen erforscht werden. Das Verständnis mikrobieller Wechselwirkungen von Pilzen ist ein wesentlicher Schritt zur Definition und Erhaltung des Bodenmikrobioms. Dieses Wissen kann für die Entwicklung neuartiger Biokontrollmittel mit nachhaltiger Landwirtschaft genutzt werden.Bereiten Sie zunächst etwa 40 Gramm Poly(dimethylsiloxan) oder PDMs vor, indem Sie die Base und den Härter im Verhältnis 10 zu 1 mit einem Spatel in einem sauberen Plastikbecher gründlich mischen. Um alle Luftblasen zu entfernen, stellen Sie den Becher für eine Stunde in eine Vakuumkammer. Als nächstes befestigen Sie die Master-Form mit klarem Klebeband in einer Kunststoffhalterung und verwenden Sie komprimierte gefilterte Luft, um Staubpartikel zu entfernen, dann gießen Sie die PDMs auf die Mitte der Master-Form und lassen Sie sie absetzen.Um die Ablagerung von Staubpartikeln auf der PDM-Oberfläche zu verhindern, bedecken Sie die Masterform locker mit einem Kunststoffdeckel, geben Sie dann die Masterform in einen Ofen und härten Sie über Nacht bei 70 Grad Celsius aus. Nachdem Sie die Master-Form aus dem Ofen genommen und abkühlen lassen, schälen Sie die ausgehärteten PDMs von der Master-Form und dem Kunststoffrahmen weg, ohne die Master-Form in den PDMs zu beschädigen. Um eine staubfreie Oberfläche zu erhalten, legen Sie klares Klebeband über die Mikrokanäle, die in die PDMs geprägt sind.Als nächstes verwenden Sie eine montierte Guillotine oder eine Rasierklinge, um die PDMs in Platten zu schneiden, wie vom Design vorgesehen. Stellen Sie beim Schneiden der seitlichen Öffnung der PDMs-Platte, die für das bakteriell-pilzliche Interaktionsgerät oder BFI-Gerät verwendet wird, sicher, dass die Mikrokanäle vollständig geöffnet sind. Bei PDMs-Platten, die bei der Montage des Pilz-Pilz-Interaktionsgeräts (FFI) verwendet werden, sollte jedoch jede Ecke so zugeschnitten werden, dass sie in eine Petrischale mit Glasboden passt.Als nächstes verwenden Sie einen Präzisionsschneider, um Einlass- oder Auslasslöcher entsprechend dem Gerätedesign zu stanzen. Als nächstes tauchen Sie die PDMs-Platten in eine 0,5-molare Natriumhydroxidlösung. Spülen Sie die Platten in sterilem doppelt destilliertem Wasser ab, bevor Sie sie in eine 70%ige Ethanollösung überführen.Nachdem Sie das Ethanol entfernt und die Platten erneut mit doppelt destilliertem sterilem Wasser gespült haben, tauchen Sie die Platten fünf Minuten lang in steriles doppelt destilliertes Wasser und Ultraschall, entfernen Sie dann die PDMs-Platte aus dem Wasser, trocknen Sie sie mit komprimierter gefilterter Luft und legen Sie sie in eine sterile quadratische Petrischale. Als nächstes brüten Sie die Petrischale mit PDMs-Platte in einem Ofen bei 70 Grad Celsius für eine Stunde. Sobald die Brammen in einer staubfreien Umgebung abgekühlt sind, entfernen Sie Staub von ihrer Oberfläche mit Klebeband und komprimierter gefilterter Luft.Um die Oberflächen der PDM-Platten und Glasboden-Petrischalen zu aktivieren, die anschließend miteinander verbunden werden, legen Sie sie in einen Plasmareiniger, wobei die zu aktivierenden Oberflächen nach oben zeigen. Nachdem Sie die PDMs-Platte in den Petrischalen aus dem Plasmareiniger entfernt haben, verbinden Sie sie sanft, indem Sie die aktivierten Oberflächen in konformen Kontakt miteinander bringen. Bond BFI und FFI PDMs Platte mit Petrischalen von 35 Millimeter bzw. 55 Millimeter Durchmesser, um die erfolgreiche Verklebung zu überprüfen, versuchen Sie, das PDMs-Labor von seiner Petrischale mit einer Pinzette zu ziehen.Visualisieren Sie das Gerät sorgfältig mit dem Auge oder durch generische Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Impfeinlässe oder Mikrokanäle nicht kollabieren. Für wassergesättigte oder nährstoffreiche Bedingungen pipettieren Sie 100 Mikroliter der gewünschten Lösung, um BFI-Geräte unmittelbar nach dem Verkleben zu füllen. Für FFI-Geräte fügen Sie 30 Mikroliter des Mediums in jeden Einlass hinzu.Zum Schluss fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Für ungesättigte Wasserbedingungen fügen Sie jedoch einfach 100 bis 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Für die Pilzimpfung entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube mit einem sterilisierten Korkbohrer einen Agarstopfen aus einer Kolonie am Rande einer drei Tage alten Kultur, um sicherzustellen, dass die wachsende Hyphenfront intakt bleibt.Dann führen Sie den Agarplug in den Pilzeinlass des BFI- und / oder FFI-Geräts ein, wobei die Myzelseite in der Hyphenfront auf die Mikrokanalöffnungen ausgerichtet ist, um die Hypheninfiltration der Kanäle zu fördern. Für das FFI-Gerät führen Sie einen weiteren Agarstopfen mit einer zweiten Pilzart in den gegenüberliegenden Einlass ein. Als nächstes verschließen Sie die Petrischale mit einer transparenten Folie und inkubieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln bis zur Bildgebung.Für die bakterielle Impfung pipettieren Sie nach dem Entfernen des BFI-Geräts aus dem Inkubator 10 Mikroliter einer bakteriellen Suspension in den bakteriellen Einlass in einer sterilen Umgebung. Sobald die Petrischale mit einer transparenten Folie versiegelt ist, lagern Sie das Gerät aufrecht bei 25 Grad Celsius im Dunkeln, bis die Bildgebung beginnt. Mit diesem Protokoll konnte die Wechselwirkung zwischen dem Pilz Coprinopsis cinerea und dem Bakterium Bacillus subtilis erfolgreich visualisiert werden.Es wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Bakteriums die Wachstumsrate des Pilzes nach etwa fünf Stunden Kookulation drastisch abnahm. Darüber hinaus hatten die mit den Bakterien assoziierten Pilzhyphen ein dünnes und transparentes Aussehen. Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zeigte auch einen Pilzhyphenkollaps nach fünf Stunden Koinokulation mit Bacillus subtilis.Ab sechs Stunden begann jedoch auch die Bakterienpopulation zu sinken. Die Visualisierung von Pilz-Pilz-Wechselwirkungen zeigte, dass Fusarium graminearum das Wachstum von Trichoderma rossicum stark hemmte, was mit der Fluoreszenzmikroskopie offensichtlich war. Dieses Protokoll zeigte außerdem signifikante morphologische Veränderungen im Pilz Verticillium longisporum in Gegenwart der Bakterien Pseudomonas synxantha und Pseudomonas fluorescens.Die in der Studie verwendete hochauflösende dynamische Bildgebungstechnik zeigte auch die Bildung von Septen in Fusarium graminearum in Gegenwart des Pilzes Clonostachys rosea. Die Fluoreszenzmarkierung ermöglichte die dynamische Quantifizierung der Proliferation von Clonostachys rosea hyphal im FFI-Gerät. Diese Geräte können vom Benutzer angepasst und modifiziert werden, um verschiedene Arten von Interesse einzubeziehen und ihre spezifischen experimentellen Fragen zu mikrobiellen Pilzinteraktionen zu beantworten.Sowohl die BFI- als auch die FFI-Geräte haben wissenschaftliche Grenzen überschritten und gezeigt, wie Pilze Abwehrsignale und Nährstoffe beim Angriff von Pilzen, Viren und Nematoden verbreiten und Untersuchungen zur Bakterienausbreitung ermöglichen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Einem mikrofluidischen-basierte Hydrodynamische Trap für einzelne Teilchen

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Forschung

Biotechnik

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...