Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

אנו מכירים בתמיכה כספית מהמחלקה לביו-הנדסה באימפריאל קולג' בלונדון ומקרן Leverhulme (הפניה למענק מחקר: RPG-2020-352).

הערה: סיכום של ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מתואר באופן חזותי באיור 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של המתודולוגיה המוצגת המורכב מחמישה חלקים עיקריים המפורטים בפרוטוקול זה.</str...

מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות באמצעות מיקרופלואידיקה של ערוצים. המחברים שואפים להדגים את הרבגוניות של מכשירים אלה ולעודד הסתגלות שתתאים לתחומי העניין של החוקר. באמצעות מכשירי BFI ו-FFI למופת, ניתן לחקור אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות בפירוט רב יותר מאש...

אדמה היא סביבה מגוונת במיוחד המכילה שפע של מיקרואורגניזמים המסייעים למחזורי פחמן וזרחן 1,2. פטריות נימה הן מרכיב מרכזי במערכות אקולוגיות רבות כמפרקים של חומר אורגני ואנאורגני ויכולות לשפר את התזונה של צמחים באמצעות יצירת יחסים סימביוטיים 3,4. בתוך האדמה, פטריות מתקשרות באופן דינמי עם מספר רב של מיקרובים כגון פטריות אחרות5, חיידקים6, וירוסים7 ונמטודות8. לאינטראקציות אלה יש השלכות משמעותיות על בריאות הקרקע והצמחים. עם זאת, בשל היעדר מערכות ניסיוניות מתאימות המסוגלות להדמיית מיקרואורגניזמים מתקשרים עם מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה, רבים נותרו בלתי מוגדרים.
לחקירות הנוגעות לאינטראקציות בין חיידקים לפטריות (BFIs) ולאינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות (FFIs) יש יישומים בעלי ערך במגוון תחומים, כולל חומרים אנטי-מיקרוביאליים ברפואה וחומרי הדברה ביולוגית בחקלאות. לדוגמה, הפטרייה Coprinopsis cinerea מייצרת את הפפטיד קופסין, אשר הוכח כי הוא מפגין פעילות אנטיבקטריאלית נגד הפתוגן האנושי ליסטריה מונוציטוגנים9. באופן דומה, התרכובת שמקורה בפטריות, griseofulvin, נמצאת בשימוש נרחב כטיפול בזיהומים פטרייתיים אנושיים והיא גם מסוגלת לעכב את הצמיחה של הפטרייה הפתוגנית הצמחית Alternaria solani10,11. מספר זנים של החיידק השוכן בקרקע, Bacillus subtilis, הוכחו גם כחומרים ביו-מבוקרים יעילים של הפתוגן הצמחי הפטרייתי Rhizoctonia solani 12,13. עם זאת, בשל מגבלות הקשורות למתודולוגיות מסורתיות, BFIs ו- FFIs אינם מובנים היטב ברמה של תאים בודדים.
מחקרים קונבנציונליים חוקרים בדרך כלל BFIs ו-FFIs על המאקרו-קנה מידה באמצעות לוחות אגר עם שני מינים או יותר שנמצאים בעימות. האינטראקציה ביניהם נבחנת על ידי מדידת קצבי גדילה וייצור מטבוליטים של המינים המתעמתים 14,15,16; עם זאת, מתודולוגיה זו נפתרת רק לרמת המושבה. כדי לחקור אינטראקציות ברמה התאית, ניתן לטפח אינוקולנטים חיידקיים ופטרייתיים על גבי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופות באגר שמצולמות לאחר מכן תחת מיקרוסקופ17. עם זאת, זה יכול להיות קשה לעקוב אחר hypha יחיד באמצעות שקופיות מיקרוסקופ בשל חוסר כליאה, כלומר תמונות קיטועי זמן קשה יותר להשיג. יתר על כן, ההזדמנות להגביל מרחבית מיקרואורגניזמים אחרים בתוך אזורים מוגדרים של התפטיר הפטרייתי או ליצור סביבות כימיות מוגדרות שניתן להפריע להן, למשל, אינה אפשרית במערכים כאלה. אופי "הקופסה השחורה" של האדמה מוסיף גם למורכבות של חקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה של תאים בודדים18. על ידי התבוננות במינים מתקשרים הרחק מהמגוון המדהים של המיקרוביום הקרקעי, ניתן להעריך את האופן המדויק שבו חברים בודדים מתקשרים. לפיכך, קיים צורך מתמשך בפלטפורמות רב-תכליתיות המאפשרות הדמיה חד-תאית ברזולוציה גבוהה של BFIs ו-FFIs.
טכנולוגיות מיקרופלואידיות, מה שמכונה מערכות מעבדה על שבב, מספקות פלטפורמה אידיאלית לחקר BFIs ו- FFIs ברמה של תאים בודדים. תחום המיקרופלואידיקה, שמקורו בטכנולוגיות שפותחו לצורך אנליזה כימית ומיקרו-אלקטרוניקה, אומץ על ידי מדעי הביולוגיה19. טכנולוגיות מיקרופלואידיות מווסתות כמויות קטנות של נוזלים בתוך רשת מותאמת אישית של תעלות ממוזערות, בעלות ממד אחד לפחות בסולם המיקרומטר, והשימוש בהן במחקר ביולוגי מתרחבל-20. בפרט, התקנים מיקרופלואידיים פותחו כדי לבחון את הצמיחה של פטריות נימה 21,22,23,23,24,25,26,27,28,29,30. אחד היתרונות של שימוש בטכנולוגיה זו הוא שכליאה של hyphae והתפלגות חומרי המזון בתוך מיקרו-ערוצים דומה יותר למבנה סביבת הקרקע מאשר שיטות אגר קונבנציונליות31. לאחרונה, פלטפורמות מיקרופלואידיות שימשו כדי לחקור אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין פתוגנים פטרייתיים32, חיידקים ושורשי צמחים33, כמו גם פטריות ונמטודות34,35.
אחד היתרונות הרבים של שימוש במיקרופלואידיקה לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות כולל את הבקרה הספציפית של סביבת המיקרו-ערוצים. לדוגמה, ניתן לנצל משטרי זרימה למינריים כדי ליצור גרדיאנטים מוגדרים של ריכוז, וזה שימושי במיוחד כאשר בוחנים את הכימוטקסיס החיידקי36. יתרון נוסף הוא שהאופי השקוף של פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS), פולימר אלסטומרי זול וניתן להתאמה ביולוגית הנפוץ בייצור התקנים מיקרופלואידיים, מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שדה בהיר ופלואורסצנטי37. באופן דומה, כליאה של מיקרובים בתוך מיקרו-ערוצים פירושה שניתן לבצע ניסויים בהילוך מהיר העוקב אחר תאים בודדים, מה שמאפשר לרשום ולכמת תגובות תאיות בודדות37. לבסוף, מכיוון שניתן לתכנן התקנים מיקרופלואידיים כך שיהיו ידידותיים למשתמש, הם יכולים להיות מועסקים בקלות על ידי אנשים שאינם מומחים38.
קידום הידע על יחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים שוכני קרקע חשוב לשיפור שיטות ניהול אקולוגיות בנות קיימא השומרות על המגוון הביולוגי ולמיתון ההשפעה של שינויי האקלים על סביבות יבשתיות39. לפיכך, פיתוח כלים מיקרופלואידיים חדשניים הוא בסיסי להרחבת ההבנה של פטריות והאינטראקציות שלהן ברמה התאית. הפרוטוקול כאן יתמקד בשני התקנים מיקרופלואידיים שיוצרו עבור המחקר של BFIs40 ו-FFIs41 כפי שהם מיוצגים באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> איור 1: ייצוג חזותי וסכמטי של התקני האינטראקציה החיידקית-פטרייתית (BFI) והתקני האינטראקציה הפטרייתית-פטרייתית (FFI). תקע תפטיר ממוקם בכניסה לקצה אחד של המיקרו-ערוצים כדי לאפשר צמיחת היפל לתוך המכשיר. המפרצון החיידקי נמצא בקצה הנגדי. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (B) סקירה סכמטית של התקן ה- BFI, המתארת את המיקום של מפרצוני החיידקים ואת כיוון הצמיחה ההיפלית באמצעות מיקרו-ערוצי האינטראקציה. הערוצים הם בעומק של 10 מיקרומטר, ברוחב של 100 מיקרומטר ובאורך של 7 מ"מ, עם 28 ערוצי תצפית בסך הכל. (C) מבחן עימות על לוח אגר בין Coprinopsis cinerea ו Bacillus subtilis NCIB 3610, סרגל קנה מידה = 20 מ"מ (משמאל). תמונות מיקרוסקופיה מראות את האינטראקציה בין C. cinerea ו- B. subtilis NCIB 3610 בתוך המיקרו-ערוץ (האמצעי והימין), כלומר חיבור קוטבי של חיידקים להיפאה פטרייתית. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר (באמצע) ו- 10 מיקרומטר (מימין). (D) תמונה של מכשיר ה-FFI המחובר לצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית, מחוסנת פעמיים בתקעים תפטיריים. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) סקירה סכמטית של התקן ה- FFI. שני תקעי אינוקולנט פטרייתיים מוכנסים לתוך המפרצים בשני קצות המכשיר, ומאפשרים חקירה היפלית של המיקרו-ערוצים. ערוצי הבקרה מחוברים לכניסה פטרייתית אחת בלבד ויש להם ערוץ ללא מוצא, מה שמונע אינטראקציות בין פטריות הבדיקה. ערוצי אינטראקציה מחברים בין שני המפרצים הפטרייתיים ומאפשרים אינטראקציות היפאליות בין הנבדקים בתוך המיקרו-ערוץ. כל תעלת אינטראקציה מורכבת מ-18 מקטעים בצורת יהלום, באורך כולל של 8.8 מ"מ (490 x 430 מיקרומטר ליהלום), בעומק של 10 מיקרומטר ובבעל אזור חיבור בין כל יהלום של 20 מיקרומטר. סוגי הערוצים משוכפלים, סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. (F) אזור אינטראקציה בין שתי חזיתות היפל מתקרבות, הגדלות מקצוות מנוגדים של ערוץ האינטראקציה המחובר. תמונת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה, סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. הלוחות באיור זה שונו מ-Stanley et al., 2014 (A-C)40 ו-Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

פטריות נימה הן תושבות מוצלחות של הקרקע וממלאות תפקיד מרכזי במערכות אקולוגיות בקרקע, כגון בפירוק חומר אורגני ואנאורגני, כמו גם בוויסות רמות חומרי ההזנה. שם הם גם מוצאים הזדמנויות רבות לקיים אינטראקציה עם מגוון של מיקרובים אחרים כגון חיידקים או פטריות אחרות. עם זאת, חקר אינטראקציות פטרייתיות ברמה התאית יכול להיות מאתגר בשל האופי דמוי הקופסה השחורה של האדמה. כלים מיקרופלואידיים חדשים מפותחים לחקר אינטראקציות פטרייתיות; מודגשות שתי פלטפורמות שנועדו לחקור אינטראקציות חיידקיות-פטרייתיות ופטרייתיות-פטרייתיות. בתוך מיקרו-ערוצים אלה, ניתן לנטר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות בסביבות פיסיקליות-כימיות מבוקרות ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה יותר ממה שהיה אפשרי בעבר. היישום של כלים אלה הניב תובנות ביולוגיות חדשניות רבות, כגון תצפית על התקשרות קוטבית חיידקית להיפאים או חשיפת אנטגוניזמים פטרייתיים-פטרייתיים לא אופייניים. מאפיין מרכזי של מתודולוגיות אלה מתייחס לקלות השימוש בכלי זה על ידי אנשים שאינם מומחים, מה שמניב טכנולוגיות הניתנות לתרגום גבוה לשימוש במעבדות מיקרוביולוגיה.

תוצאות מייצגות מוצגות ממכשירי BFI40 ו- FFI41 למופת. ניתן להשיג בקלות מדידות קצב גדילה של Hyphal באמצעות מכשירים אלה בשילוב עם טכניקות מיקרוסקופיה בסיסיות. איור 3A-B ממחיש את האינטראקציות בין חיידקים לפטריות בין C. cinerea hyphae לבין B. subti...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

באמצעות המכשירים המיקרופלואידיים המוצגים, אנו יכולים לבחון אינטראקציות דינמיות בין פטריות למיקרובים אחרים באמצעות בקרה מרחבית וסביבתית מדויקת, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד. חשוב לציין, ניתן להגביל את הצמיחה הפטרייתית ולכוון אותה בתוך הערוץ המיקרופלואידי. מאפשרת קבלת תמונות באיכות גבוהה של חלוף זמן.לכן, ניתן לחקור את המורכבות של אינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות ופטרייתיות-חיידקיות. הבנת אינטראקציות מיקרוביאליות פטרייתיות היא שלב חיוני בהגדרה ובשימור של המיקרוביום של הקרקע. ידע זה יכול להיות מנוצל לפיתוח של סוכני ביו-קונטרול חדשניים עם חקלאות בת קיימא.כדי להתחיל, להכין כ -40 גרם של פולי (dimethylsiloxane) או PDMs, על ידי ערבוב יסודי של הבסיס ואת חומר הריפוי ביחס של 10 ל -1 באמצעות מרית בכוס פלסטיק נקייה. כדי להסיר את כל בועות האוויר, מניחים את הכוס בתא ואקום למשך שעה. לאחר מכן, באמצעות סרט שקוף, אבטח את התבנית הראשית לתוך תושבת פלסטיק והשתמש באוויר מסונן דחוס כדי להסיר את חלקיקי האבק, ואז שפך את ה- PDMs על מרכז התבנית הראשית ואפשר לה לשקוע.כדי למנוע התיישבות של חלקיקי אבק על פני השטח של PDMs, מכסים באופן רופף את התבנית הראשית במכסה פלסטיק, ואז מעבירים את התבנית הראשית לתנור ומרפאים לילה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת תבנית המאסטר מהתנור ומתן אפשרות להתקרר, קלפו את ה-PDMs שנרפאו הרחק מהתבנית הראשית וממסגרת הפלסטיק מבלי לפגוע בתבנית הראשית ב-PDMs. לאחר מכן, כדי לשמור על משטח נטול אבק, הניחו סרט דביק שקוף על המיקרו-ערוצים המובלטים ב-PDMs.לאחר מכן, השתמש בגיליוטינה רכובה או בסכין גילוח כדי לחתוך את ה- PDMs ללוחות כפי שצוין על ידי העיצוב. בעת חיתוך הפתח הצדדי של לוח ה- PDMs המשמש למכשיר האינטראקציה החיידקית-פטרייתית, או התקן ה- BFI, ודא שהמיקרו-ערוצים פתוחים במלואם. עם זאת, עבור לוחות PDMs המשמשים בהרכבה של התקן האינטראקציה הפטרייתית-פטרייתית, או FFI, יש לקצץ כל פינה כך שתתאים לצלחת פטרי תחתונה מזכוכית.לאחר מכן, השתמש בחותך מדויק כדי לנקב חורי כניסה או שקע בהתאם לתכנון המכשיר. לאחר מכן, הטביע את לוחות ה- PDMs לתמיסת נתרן הידרוקסיד טוחנת 0.5. יש לשטוף את הלוחות במים סטרילים עם זיקוק כפול לפני העברתם לתמיסת אתנול של 70%.לאחר הסרת האתנול ושטיפת הלוחות במים סטריליים מזוקקים כפולים שוב, טבלו את הלוחות במים מזוקקים כפולים סטריליים וסוניקטים במשך חמש דקות, ואז הסירו את לוח ה-PDMs מהמים, ייבשו אותם באוויר מסונן דחוס והניחו אותם בצלחת פטרי מרובעת סטרילית. לאחר מכן, דגירה של צלחת פטרי עם לוח PDMs בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר שהלוחות התקררו בסביבה נטולת אבק, נקו כל אבק מפני השטח שלהם באמצעות סרט הדבקה ואוויר מסונן דחוס.כדי להפעיל את המשטחים של לוחות ה-PDMs ואת צלחות הפטרי התחתונות מזכוכית, אשר יחוברו לאחר מכן יחד, הניחו אותם במנקה פלזמה כאשר המשטחים יופעלו פונים כלפי מעלה. לאחר הסרת לוח ה-PDMs בצלחות הפטרי ממנקה הפלזמה, קשרו אותם בעדינות על ידי הצבת המשטחים המופעלים במגע קונפורמי זה עם זה. לוח BFI ו-FFI PDMs של בונד עם צלחות פטרי בקוטר 35 מילימטר ו-55 מילימטרים, בהתאמה לבדיקת ההדבקה המוצלחת, מנסים למשוך את מעבדת ה-PDMs מצלחת הפטרי שלה עם פינצטה.דמיינו את המכשיר בקפידה עם העין או על ידי מיקרוסקופיה גנרית כדי להבטיח שאין קריסה של פתחי החיסון או המיקרו-ערוצים. עבור תנאים רוויי מים או עשירים בחומרים מזינים, פיפטה 100 מיקרוליטרים של הפתרון הרצוי כדי למלא התקני BFI מיד לאחר ההדבקה. עבור התקני FFI, הוסף 30 מיקרוליטרים של המדיה לכל כניסה.לבסוף, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים סטריליים לצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. עם זאת, עבור מים בתנאים בלתי רוויים, פשוט הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים מזוקקים כפולים לצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. לחיסון פטרייתי, בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי, באמצעות בור שעם מעוקר, מוציאים תקע אגר ממושבה בשולי תרבות בת שלושה ימים, ומבטיחים לשמור על חזית ההיפל ההולכת וגדלה ללא פגע.לאחר מכן הכנס את תקע האגר לתוך הכניסה הפטרייתית של מכשיר ה- BFI ו/ או ה- FFI כאשר צד התפטיר למטה בחזית ההיפל מכוון לכיוון פתחי המיקרו-ערוצים כדי לעודד חדירה היפל של הערוצים. עבור מכשיר ה- FFI, הכנס תקע אגר נוסף עם מין פטרייתי שני לתוך המפרצון הנגדי. לאחר מכן, אטמו את צלחת הפטרי עם סרט שקוף ודגרו בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך עד להדמיה.עבור חיסון חיידקים, לאחר הסרת מכשיר ה- BFI מהאינקובטור, פיפטה 10 מיקרוליטרים של תרחיף חיידקי לתוך המפרצון החיידקי בסביבה סטרילית. ברגע שצלחת הפטרי נאטמת בסרט שקוף, אחסנו את המכשיר זקוף בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך עד לתחילת ההדמיה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לדמיין בהצלחה את האינטראקציה בין הפטרייה Coprinopsis cinerea לבין החיידק Bacillus subtilis.נצפה כי בנוכחות החיידק, קצב הגדילה של הפטרייה החל לרדת באופן דרסטי לאחר כחמש שעות של קוינוקולציה. יתר על כן, ההיפרה הפטרייתית הקשורה לחיידקים הייתה בעלת מראה דק ושקוף. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר חשפו גם קריסת היפא פטרייתית לאחר חמש שעות של קוינוקולציה עם Bacillus subtilis.עם זאת, משש שעות ואילך, גם אוכלוסיית החיידקים החלה לרדת. הדמיה של אינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות הראתה כי Fusarium graminearum עיכב מאוד את הצמיחה של Trichoderma rossicum, אשר ניכר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה חשף גם שינויים מורפולוגיים משמעותיים בפטרייה Verticillium longisporum בנוכחות החיידקים Pseudomonas synxantha ו- Pseudomonas fluorescens.טכניקת ההדמיה הדינמית ברזולוציה גבוהה ששימשה במחקר גילתה גם היווצרות ספטה ב- Fusarium graminearum בנוכחות הפטרייה Clonostachys rosea. תיוג פלואורסצנטי העניק את הכימות הדינמי של התפשטות ההיפל Clonostachys rosea במכשיר ה-FFI. התקנים אלה יכולים להיות מותאמים ומשונים על ידי המשתמש כדי לשלב מינים שונים של עניין ולהתייחס לשאלות הניסוי הספציפיות שלהם הנוגעות לאינטראקציות מיקרוביאליות פטרייתיות.הן מכשירי ה-BFI והן מכשירי ה-FFI דחפו גבולות מדעיים, וחשפו כיצד פטריות מפיצות אותות הגנה וחומרים מזינים עם התקפה על ידי פטריות, וירוסים, נמטודות ומאפשרות לחקור את פיזור החיידקים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...