Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

우리는 임페리얼 칼리지 런던의 생명 공학과와 Leverhulme Trust (연구 보조금 참조 : RPG-2020-352)의 재정 지원을 인정합니다.

참고: 이 프로토콜에 설명된 절차에 대한 요약은 그림 2에 시각적으로 묘사되어 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> 그림 2: 이 프로토콜에 자세히 설명된 다섯 개의 주요 섹션으로 구성된 제시된 방법론의 개략적인 표현. 장치 설계는 CAD(컴퓨터 지?...

이 기사는 채널 미세 유체학을 사용하는 곰팡이 - 미생물 상호 작용의 연구를위한 프로토콜을 제시합니다. 저자는 이러한 장치의 다양성을 입증하고 연구자의 이익에 맞게 적응을 장려하는 것을 목표로합니다. 예시적인 BFI 및 FFI 장치를 사용하여, 진균-미생물 상호작용은 이전에 접근가능한 것보다 더 상세하게 연구될 수 있다. 토양의 배경 복잡성과 이질성을 제거하고, 균사의 성장을 단일 단층?...

토양은 탄소와 인 순환 1,2에 도움이되는 풍부한 미생물을 포함하는 매우 다양한 환경입니다. 필라멘트 균류는 유기 및 무기 물질의 분해제로서 수많은 생태계의 주요 구성 요소이며 공생 관계형성 3,4을 통해 식물의 영양을 향상시킬 수 있습니다. 토양 내에서 곰팡이는 다른 곰팡이5, 박테리아6, 바이러스7 및 선충류8과 같은 수많은 미생물과 동적으로 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 토양과 식물 건강에 중요한 영향을 미칩니다. 그러나 고해상도로 상호 작용하는 미생물을 이미징 할 수있는 적절한 실험 시스템이 없기 때문에 많은 사람들이 정의되지 않은 채로 남아 있습니다.
박테리아 - 곰팡이 상호 작용 (BFI) 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 (FFIs)에 관한 조사는 의학의 항균제 및 농업의 생물학적 조절제를 포함하여 다양한 분야에서 가치있는 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 예를 들어, 곰팡이 코프리놉시스 시네레아는 펩티드 콥신을 생산하며, 이는 인간 병원체 리스테리아 모노사이토게네스9에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 유사하게, 진균 유래 화합물인 그리세오풀빈은 인간 진균 감염에 대한 치료제로서 널리 이용되며, 추가적으로 식물 병원성 진균인 알터나리아 솔라니10,11의 성장을 억제할 수 있다. 토양 거주 박테리아 바실러스 서브틸리스의 몇몇 균주는 또한 진균 식물 병원균인 리조토니아 솔라니12,13의 효과적인 생물조절제인 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고 전통적인 방법론과 관련된 한계로 인해 BFI 및 FFI는 단일 셀 수준에서 제대로 이해되지 않습니다.
전통적인 연구는 일반적으로 두 종 이상의 종과 대결하는 한천 플레이트를 사용하여 매크로 스케일에서 BFI와 FFI를 탐구합니다. 이들의 상호작용은 대립하는 종14,15,16의 성장 속도와 대사산물 생산을 측정함으로써 평가된다; 그러나이 방법론은 식민지 수준에서만 해결됩니다. 세포 수준에서의 상호작용을 연구하기 위해, 박테리아 및 진균 접종제는 한천으로 코팅된 유리 현미경 슬라이드에서 배양될 수 있고, 그 후 현미경(17)으로 이미지화된다. 그럼에도 불구하고 감금이 부족하기 때문에 현미경 슬라이드를 사용하여 단일 hypha를 따르는 것이 어려울 수 있으며, 이는 타임랩스 이미지를 얻기가 더 어렵다는 것을 의미합니다. 또한, 진균 균사체의 정의된 영역 내에 다른 미생물을 공간적으로 가두거나 교란될 수 있는 정의된 화학적 환경을 만들 수 있는 기회는, 예를 들어, 이러한 셋업에서 가능하지 않다. 토양의 "블랙 박스"특성은 또한 단일 세포(18)의 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 연구하는 복잡성을 추가합니다. 토양 미생물의 놀라운 다양성에서 벗어나 상호 작용하는 종을 관찰함으로써 개별 구성원이 상호 작용하는 정확한 방식을 평가할 수 있습니다. 따라서 BFI 및 FFI의 고해상도, 단일 셀 이미징을 가능하게 하는 다목적 플랫폼에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
마이크로유체 기술, 소위 랩온어칩 시스템(lab-on-a-chip systems)은 단일 세포 수준에서 BFI 및 FFI 연구를 위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 화학 분석 및 마이크로 일렉트로닉스를 위해 개발 된 기술에서 유래 한 미세 유체 공학 분야는 생물 과학19에 의해 채택되었습니다. 마이크로유체 기술은 마이크로미터 규모에서 적어도 하나의 차원을 갖는 소형화된 채널의 맞춤형 네트워크 내에서 소량의 유체를 조절하며, 생물학적 연구에서의 사용은 확대되고 있다20. 특히, 사상균21,22,23,24,25,26,27,28,29,30의 성장을 조사하기 위해 미세유체 장치가 개발되었다. 이 기술을 사용하는 한 가지 이점은 균사의 감금과 마이크로 채널 내의 영양소 분포가 기존의 한천 방법(31)보다 토양 환경의 구조와 더 밀접하게 유사하다는 것입니다. 최근에, 미세유체 플랫폼이 인간 호중구와 진균 병원체(32), 박테리아 및 식물 뿌리(33), 진균 및 선충류(34,35) 사이의 상호작용을 조사하기 위해 이용되고 있다.
미생물 상호작용을 연구하기 위해 마이크로유체학을 사용하는 많은 이점 중 하나는 마이크로채널 환경의 특이적 조절을 포함한다. 예를 들어, 층류 정권은 정의된 농도 구배를 생성하기 위해 이용될 수 있으며, 이는 박테리아 화학주성(36)을 검사할 때 특히 유용하다. 또 다른 장점은 미세 유체 장치의 제조에 일반적으로 사용되는 저렴하고 생체 적합성 엘라스토머 폴리머 인 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 투명한 특성이 밝은 필드 및 형광 현미경(37)을 사용하여 단일 세포의 고해상도 이미징을 용이하게한다는 것입니다. 마찬가지로, 마이크로채널 내의 미생물의 감금은 단일 세포를 추적하는 타임랩스 실험이 수행될 수 있다는 것을 의미하며, 개별 세포 반응이 기록되고 정량화될 수 있게 한다(37). 마지막으로, 미세유체 장치가 사용자 친화적으로 설계될 수 있기 때문에, 이들은 비전문가(38)에 의해 용이하게 이용될 수 있다.
토양-거주 미생물 사이의 상호작용에 대한 지식을 증진시키는 것은 생물 다양성을 유지하는 지속 가능한 생태계 관리 관행을 개선하고 기후 변화가 육상 환경에 미치는 영향을 완화하는 데 중요하다39. 따라서, 새로운 미세유체 도구의 개발은 세포 수준에서 곰팡이와 그들의 상호 작용에 대한 이해를 넓히는 데 필수적입니다. 여기서 프로토콜은 그림 1에 표시된 바와 같이 BFIs(40) 및 FFIs(41)의 연구를 위해 생산된 두 개의 미세유체 장치에 초점을 맞출 것이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> 그림 1: 박테리아-진균 상호작용(BFI) 및 곰팡이-진균 상호작용(FFI) 장치의 시각적 및 개략적 표현. (A) BFI 장치의 이미지. 균사 플러그는 마이크로 채널의 한쪽 끝 입구에 배치되어 장치로 하이팔 성장을 허용합니다. 박테리아 입구는 반대쪽 끝에 있습니다. 스케일 바 = 5 mm. (B) 상호작용 마이크로채널을 통한 박테리아 입구의 위치 및 최면 성장의 방향을 묘사하는 BFI 장치의 개략적인 개요. 채널은 깊이 10μm, 너비 100μm, 길이 7mm이며 총 28개의 관측 채널이 있습니다. (c) Coprinopsis cinerea와 Bacillus subtilis NCIB 3610 사이의 한천 플레이트에서의 대결 분석, 스케일 바 = 20 mm (왼쪽). C. cinerea와 B. subtilis NCIB 3610 내 마이크로채널(중간 및 오른쪽) 사이의 상호작용, 즉 진균균 균사에 대한 박테리아의 극성 부착을 보여주는 현미경 이미지. 스케일 바 = 25 μm (중간) 및 10 μm (오른쪽). (d) 균사체 플러그로 이중 접종된 유리 바닥 페트리 접시에 결합된 FFI 장치의 이미지. 스케일 바 = 1cm. (E) FFI 장치의 개략적인 개요. 두 개의 곰팡이 접종제 플러그가 장치의 양쪽 끝에있는 입구에 도입되어 마이크로 채널의 최면 탐사가 가능합니다. 제어 채널은 하나의 진균 유입구에만 연결되며 막 다른 채널을 가지고있어 테스트 진균 간의 상호 작용을 방지합니다. 상호작용 채널은 진균 유입구를 연결하고 마이크로채널 내의 피험자 사이의 최면 상호작용을 허용한다. 각 인터랙션 채널은 18개의 다이아몬드 모양의 섹션으로 구성되며, 총 길이는 8.8mm(다이아몬드당 490 x 430μm), 깊이는 10μm, 각 다이아몬드 사이에는 20μm의 연결 영역을 가집니다. 채널 유형은 중복되고, 스케일 막대 = 1mm입니다. (F) 상호 연결된 상호 작용 채널의 반대쪽 끝에서 자라는 두 개의 접근하는 하이팔 전선 사이의 상호 작용 영역입니다. 위상차 현미경 이미지, 스케일 바 = 250 μm. 이 도면의 패널은 Stanley et al., 2014 (A-C)40 및 Gimeno et al., 2021 (D-F)41에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

필라멘트 균류는 토양의 성공적인 거주자이며 유기 및 무기 물질의 분해뿐만 아니라 영양소 수준의 조절과 같은 토양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 거기에서 그들은 또한 박테리아 나 다른 곰팡이와 같은 다양한 다른 미생물과 상호 작용할 수있는 수많은 기회를 발견합니다. 그러나 세포 수준에서 곰팡이 상호 작용을 연구하는 것은 토양의 블랙 박스와 같은 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 곰팡이 상호 작용의 연구를 위해 새로운 미세 유체 도구가 개발되고 있습니다. 박테리아 - 곰팡이 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해 고안된 두 가지 플랫폼이 강조됩니다. 이러한 마이크로채널 내에서, 진균-미생물 상호작용은 이전에 가능했던 것보다 더 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 제어된 물리-화학적 환경에서 모니터링될 수 있다. 이러한 도구의 적용은 균사에 대한 박테리아 극성 부착의 관찰 또는 특징이없는 곰팡이 - 곰팡이 적대감을 드러내는 것과 같은 수많은 새로운 생물학적 통찰력을 산출했습니다. 이러한 방법론의 주요 특징은 비 전문가가이 도구의 사용 편의성과 관련하여 미생물학 실험실에서 사용할 수있는 번역 가능성이 높은 기술을 제공합니다.

대표적인 결과는 예시 BFI40 및 FFI41 디바이스로부터 제시된다. 히팔 성장률 측정은 기본적인 현미경 기술과 함께 이러한 장치를 사용하여 쉽게 얻을 수 있습니다. 도 3A-B는 C. cinerea hyphae와 B. subtilis NCIB 3610 사이의 박테리아-진균 상호작용을 도시한다. B. subtilis의 존재는 공동 접종 후 약 5 시간 ?...

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Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

제시된 미세 유체 장치를 사용하여 균류와 다른 미생물 간의 동적 상호 작용을 정확한 공간 및 환경 제어뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 고해상도 이미징으로 검사 할 수 있습니다. 중요하게도, 진균 성장은 미세유체 채널 내에서 제한되고 지시될 수 있다. 고품질 시간 경과 이미지를 얻을 수 있습니다.따라서 곰팡이 - 곰팡이 및 곰팡이 - 박테리아 상호 작용의 복잡성을 탐구 할 수 있습니다. 곰팡이 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 토양 미생물을 정의하고 보존하는 데 필수적인 단계입니다. 이 지식은 지속 가능한 농업을 가진 새로운 생물 조절제의 개발을 위해 악용 될 수 있습니다.시작하기 위해, 약 40 그램의 폴리(디메틸실록산) 또는 PDMs를 준비하고, 깨끗한 플라스틱 컵에 주걱을 사용하여 베이스와 경화제를 10 내지 1 비율로 완전히 혼합함으로써 준비한다. 모든 기포를 제거하려면 컵을 진공 챔버에 한 시간 동안 넣으십시오. 그런 다음 투명 테이프를 사용하여 마스터 몰드를 플라스틱 마운트에 고정하고 압축 여과 된 공기를 사용하여 먼지 입자를 제거한 다음 PDM을 마스터 몰드의 중앙에 부어 정착시킵니다.PDM 표면에 먼지 입자가 침전되는 것을 방지하려면 마스터 몰드를 플라스틱 뚜껑으로 느슨하게 덮은 다음 마스터 몰드를 오븐으로 옮기고 섭씨 70도에서 밤새 경화하십시오. 오븐에서 마스터 몰드를 제거하고 냉각시킨 후, 경화된 PDM을 PDM의 마스터 몰드를 손상시키지 않으면서 마스터 몰드 및 플라스틱 프레임으로부터 떼어냅니다. 그런 다음 먼지가없는 표면을 유지하려면 PDM에 엠보싱 된 마이크로 채널 위에 투명 테이프를 놓습니다.그런 다음 장착 단두대 또는 면도날을 사용하여 PDM을 설계에서 지정한 슬래브로 자릅니다. 박테리아-진균 상호작용 장치 또는 BFI 장치에 사용되는 PDMs 슬래브의 측면 개구부를 절단할 때 마이크로채널이 완전히 열려 있는지 확인하십시오. 그러나 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 장치 또는 FFI의 조립에 사용되는 PDM 슬래브의 경우 각 모서리가 유리 바닥 페트리 접시에 맞도록 트리밍해야합니다.그런 다음 정밀 커터를 사용하여 장치 설계에 따라 입구 또는 출구 구멍을 펀치합니다. 다음으로, PDMs 슬라브를 0.5몰 수산화나트륨 용액에 침지시킨다. 슬라브를 멸균 이중 증류수로 헹구고 70% 에탄올 용액으로 옮깁니다.에탄올을 제거하고 다시 이중 증류수로 슬라브를 헹구고 슬래브를 멸균 이중 증류수에 침지하고 다섯 분 동안 초음파 처리 한 다음 PDMs 슬래브를 물에서 제거하고 압축 여과 된 공기로 건조시킨 다음 멸균 사각형 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, PDM 슬래브와 함께 페트리 접시를 섭씨 70도의 오븐에서 한 시간 동안 배양하십시오. 슬래브가 먼지가없는 환경에서 냉각되면 테이프와 압축 여과 된 공기를 사용하여 표면에서 먼지를 제거하십시오.이후에 함께 접착될 PDM 슬래브와 유리 바닥 페트리 디쉬의 표면을 활성화하려면 활성화될 표면이 위쪽을 향하도록 플라즈마 클리너에 놓습니다. 플라즈마 클리너에서 페트리 접시의 PDMs 슬래브를 제거한 후, 활성화된 표면을 서로 등각 접촉시켜 부드럽게 결합시킨다. 본드 BFI와 FFI PDM은 성공적인 본딩을 확인하기 위해 각각 직경 35mm와 55mm의 페트리 접시로 슬래브를 묶어 PDM 실험실을 핀셋으로 페트리 접시에서 떼어내려고 합니다.접종 입구 또는 마이크로 채널의 붕괴가 없도록 눈 또는 일반 현미경으로 장치를 신중하게 시각화하십시오. 물 포화 또는 영양소가 풍부한 조건의 경우, 원하는 용액 100 마이크로 리터를 피펫하여 접합 직후에 BFI 장치를 채 웁니다. FFI 장치의 경우 30마이크로리터의 미디어를 각 입구에 추가합니다.마지막으로 100 ~ 200 마이크로 리터의 멸균 이중 증류수를 페트리 접시에 첨가하여 습도를 유지하십시오. 그러나 물 불포화 조건의 경우 습도를 유지하기 위해 페트리 접시에 멸균 이중 증류수 100 ~ 200 마이크로 리터를 첨가하십시오. 곰팡이 예방 접종을 위해, 멸균 된 코르크 보어를 사용하여 층류 후드 내부에서 사흘 된 문화의 주변에있는 식민지에서 한천 플러그를 제거하여 성장하는 하이팔 앞쪽을 그대로 유지하십시오.그런 다음 한천 플러그를 BFI 및 / 또는 FFI 장치의 곰팡이 입구에 도입하여 마이크로채널 개구부를 향해 향하는 하이팔 앞쪽의 균사체 측면을 아래로 향하게하여 채널의 최면 침투를 촉진하십시오. FFI 장치의 경우, 두 번째 곰팡이 종이있는 또 다른 한천 플러그를 반대쪽 입구에 도입하십시오. 다음으로, 페트리 접시를 투명 필름으로 밀봉하고 이미징 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25 ~ 28도에서 배양하십시오.박테리아 접종을 위해, 배양기로부터 BFI 장치를 제거한 후, 멸균 환경에서 박테리아 입구 내로 박테리아 현탁액 10 마이크로리터를 피펫한다. 페트리 접시가 투명 필름으로 밀봉되면 이미징이 시작될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25도에서 장치를 똑바로 보관하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 곰팡이 Coprinopsis cinerea와 박테리아 Bacillus subtilis 사이의 상호 작용을 성공적으로 시각화 할 수 있습니다.박테리아가있는 상태에서 곰팡이의 성장 속도는 약 다섯 시간의 동전 접종 후 크게 감소하기 시작했다는 것이 관찰되었습니다. 더욱이, 박테리아와 관련된 곰팡이 균사는 얇고 투명한 외관을 가졌다. 시간 경과 형광 현미경 검사는 또한 바실러스 서브틸리스와 함께 다섯 시간의 상화 접종 후 곰팡이 균사 붕괴를 밝혀냈다.그러나 여섯 시간 이후부터는 박테리아 개체수도 감소하기 시작했다. 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용의 시각화는 Fusarium graminearum이 Trichoderma rossicum의 성장을 강하게 억제한다는 것을 보여 주었고, 이는 형광 현미경을 사용하여 분명했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 Pseudomonas synxantha 및 Pseudomonas fluorescens의 존재하에 곰팡이 Verticillium longisporum의 중요한 형태 학적 변화를 추가로 밝혀 냈습니다.연구에 사용 된 고해상도 동적 이미징 기술은 또한 곰팡이 Clonostachys rosea의 존재하에 Fusarium graminearum에서 septa 형성을 밝혀 냈습니다. 형광 표지는 FFI 장치에서 클로노스타키즈 로사 최면 증식의 동적 정량화를 제공하였다. 이러한 장치는 사용자가 관심있는 다른 종을 통합하고 곰팡이 미생물 상호 작용에 관한 특정 실험 질문을 해결하기 위해 적응 및 변형 될 수 있습니다.BFI와 FFI 장치는 모두 곰팡이, 바이러스, 선충류의 공격시 곰팡이가 방어 신호와 영양소를 전파하고 박테리아 분산에 대한 조사를 가능하게하는 방법을 밝혀 과학적 경계를 넓혔습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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단일 입자 Microfluidic 기반 유체 트랩

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

연구

생체공학

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

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태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

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Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

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A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

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Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

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