Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Vi anerkjenner økonomisk støtte fra Institutt for bioingeniør ved Imperial College London og The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

MERK: Et sammendrag av prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen, er visuelt avbildet i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk fremstilling av den presenterte metodikken bestående av fem hoveddeler som er beskrevet i denne protokollen. Enhetsdesign er laget ved hjelp av CAD-programvare (Compute...

Denne artikkelen presenterer en protokoll for studiet av sopp-mikrobielle interaksjoner ved hjelp av kanalmikrofluidikk. Forfatterne tar sikte på å demonstrere allsidigheten til disse enhetene og oppmuntre til tilpasning som passer forskerens interesser. Ved hjelp av de eksemplariske BFI- og FFI-enhetene kan soppmikrobielle interaksjoner studeres mer detaljert enn tidligere tilgjengelig. Ved å fjerne jordens bakgrunnskompleksitet og heterogenitet, moderere veksten av hyphae slik at de er begrenset til en enkelt monola...

Jord er et eksepsjonelt mangfoldig miljø som inneholder en overflod av mikroorganismer som er medvirkende til karbon- og fosforsykluser 1,2. Filamentøse sopp er en viktig komponent i mange økosystemer som nedbrytere av organisk og uorganisk materiale og kan forbedre ernæringen av planter gjennom dannelsen av symbiotiske forhold 3,4. Innenfor jord samhandler sopp dynamisk med en rekke mikrober som andre sopp5, bakterier6, virus7 og nematoder8. Disse interaksjonene har betydelige konsekvenser for jord- og plantehelsen. Likevel, på grunn av mangel på passende eksperimentelle systemer som er i stand til å avbilde interagerende mikroorganismer med høy oppløsning, forblir mange udefinerte.
Undersøkelser om bakteriell-sopp interaksjoner (BFF) og sopp-sopp interaksjoner (FFIer) har verdifulle anvendelser på en rekke felt, inkludert antimikrobielle midler i medisin og biologiske kontrollmidler i landbruket. For eksempel produserer sopp coprinopsis cinerea peptid copsin, som har vist seg å vise antibakteriell aktivitet mot det menneskelige patogenet Listeria monocytogenes9. På samme måte er den soppavledede forbindelsen, griseofulvin, mye brukt som behandling for menneskelige soppinfeksjoner og er i tillegg i stand til å hemme veksten av planten patogen sopp Alternaria solani10,11. Flere stammer av jordboende bakterie Bacillus subtilis har også vist seg å være effektive biokontrollmidler av soppplantepatogenet Rhizoctonia solani12,13. Likevel, på grunn av begrensninger knyttet til tradisjonelle metoder, er BBFIer og FFIer dårlig forstått på nivået av enkeltceller.
Konvensjonelle studier utforsker vanligvis BBFIer og FFIer på makroskalaen ved hjelp av agarplater med to eller flere arter i konfrontasjon. Deres interaksjon vurderes ved å måle vekstrater og metabolittproduksjon av de konfronterende artene 14,15,16; Denne metodikken løses imidlertid bare til koloninivå. For å studere interaksjoner på cellenivå, kan bakterielle og soppinokulanter dyrkes på glassmikroskopsklier belagt med agar som deretter avbildes under et mikroskop17. Likevel kan det være vanskelig å følge en enkelt hypha ved hjelp av mikroskoplysbilder på grunn av mangel på innesperring, noe som betyr at tidsforløpbilder er vanskeligere å få tak i. Videre er muligheten til å romlig begrense andre mikroorganismer innenfor definerte regioner i soppmiceliet eller skape definerte kjemiske miljøer som for eksempel kan bli forstyrret, ikke mulig i slike oppsett. Jordens "black box" natur legger også til kompleksiteten ved å studere sopp-mikrobielle interaksjoner på nivået av enkeltceller18. Ved å observere interagerende arter vekk fra det utrolige mangfoldet i jordmikrobiomet, kan den nøyaktige måten individuelle medlemmer samhandler på vurderes. Dermed er det et fortsatt behov for allsidige plattformer som muliggjør høyoppløselig, encellet bildebehandling av BFFIer og FFIer.
Mikrofluidisk teknologi, såkalte lab-on-a-chip-systemer, gir en ideell plattform for studiet av BFF-er og FFIer på nivået av enkeltceller. Feltet mikrofluidikk, med opprinnelse fra teknologier utviklet for kjemisk analyse og mikroelektronikk, er vedtatt av biovitenskapene19. Mikrofluidiske teknologier regulerer små mengder væsker i et skreddersydd nettverk av miniatyriserte kanaler, har minst en dimensjon på mikrometreskalaen, og bruken i biologisk forskning utvides20. Spesielt er mikrofluidiske enheter utviklet for å undersøke veksten av filamentøse sopp 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fordel med å bruke denne teknologien er at innesperring av hyphae og fordelingen av næringsstoffer i mikrokanal ligner mer på jordens struktur enn konvensjonelle agarmetoder31. Nylig har mikrofluidiske plattformer blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom menneskelige nøytrofiler og sopppatogener32, bakterier og planterøtter33, samt sopp og nematoder34,35.
En av de mange fordelene ved å bruke mikrofluidikk for å studere mikrobielle interaksjoner inkluderer den spesifikke kontrollen av mikrokanalmiljøet. For eksempel kan laminære strømningsregimer utnyttes for å generere definerte konsentrasjonsgradienter, noe som er spesielt nyttig når du undersøker bakteriell chemotaxis36. En annen fordel er at den gjennomsiktige naturen til poly (dimetylsiloksan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomerisk polymer som vanligvis brukes til fremstilling av mikrofluidiske enheter, letter høyoppløselig avbildning av enkeltceller ved hjelp av brightfield og fluorescensmikroskopi37. På samme måte betyr innesperring av mikrober i mikrokanal at tidsforløpeksperimenter som sporer enkeltceller, kan utføres, slik at individuelle cellulære responser kan registreres og kvantifiseres37. Til slutt, da mikrofluidiske enheter kan utformes for å være brukervennlige, kan de enkelt brukes av ikke-eksperter38.
Videre kunnskap om samspillet mellom jordboende mikroorganismer er viktig for å forbedre bærekraftige økosystemforvaltningspraksiser som opprettholder biologisk mangfold og for å redusere virkningen av klimaendringer på terrestriske miljøer39. Dermed er utviklingen av nye mikrofluidiske verktøy grunnleggende for å utvide forståelsen av sopp og deres interaksjoner på cellenivå. Protokollen her vil fokusere på to mikrofluidiske enheter produsert for studiet av BFIer40 og FFIer41 som representert i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figur 1: Visuell og skjematisk fremstilling av bakteriell soppinteraksjon (BFI) og sopp-soppinteraksjonsenheter (FFI). (A) Bilde av BFI-enheten. En mycelial plugg er plassert ved inngangen til den ene enden av mikrokanalene for å tillate hyphalvekst i enheten. Bakterieinntaket er i motsatt ende. Skalastang = 5 mm. (B) Skjematisk oversikt over BFI-enheten, som viser plasseringen av bakterieinntakene og retningen av hyphalvekst gjennom interaksjonsmikrokanalene. Kanalene er 10 μm i dybden, 100 μm brede og 7 mm lange, med totalt 28 observasjonskanaler. (C) Konfrontasjonsanalyse på agarplate mellom Coprinopsis sinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610, skala bar = 20 mm (venstre). Mikroskopibilder som viser samspillet mellom C. cinerea og B. subtilis NCIB 3610 innenfor mikrokanal (midten og høyre), det vil si polar festing av bakterier til sopphyphae. Skalastang = 25 μm (midten) og 10 μm (høyre). (D) Bilde av FFI-enheten festet til en glassbunnet Petri-tallerken, dobbelt inokulert med mycelialplugger. Skalastang = 1 cm. (E) Skjematisk oversikt over FFI-enheten. To soppinokulantplugger blir introdusert i innløpene i hver ende av enheten, slik at hyphalutforskning av mikrokanalene tillater hyphalutforskning av mikrokanalene. Kontrollkanaler er kun koblet til ett soppinntak og har en blind kanal, noe som forhindrer interaksjoner mellom testsvampene. Interaksjonskanaler forbinder både soppinntak og tillater hyphalinteraksjoner mellom testpersonene i mikrokanal. Hver interaksjonskanal består av 18 diamantformede seksjoner, som måler en total lengde på 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm dyp og har en forbindelsesregion mellom hver diamant på 20 μm. Kanaltyper dupliseres, skalastenger = 1 mm. (F) Interaksjonssone mellom to nærliggende hyphalfronter, som vokser fra motsatte ender av den sammenkoblede samhandlingskanalen. Fasekontrastmikroskopibilde, skalalinje = 250 μm. Panelene i denne figuren er modifisert fra Stanley et al., 2014 (A-C)40 og Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Filamentøse sopp er vellykkede innbyggere i jord og spiller en viktig rolle i jordøkosystemer, som i nedbrytning av organisk og uorganisk materiale, samt regulering av næringsnivåer. Der finner de også mange muligheter til å samhandle med en rekke andre mikrober som bakterier eller andre sopp. Å studere soppinteraksjoner på cellenivå kan imidlertid være utfordrende på grunn av jordens svarte bokslignende natur. Nye mikrofluidiske verktøy utvikles for studiet av soppinteraksjoner; to plattformer designet for å studere bakteriell-sopp og sopp-sopp interaksjoner er fremhevet. Innenfor disse mikrokanalene kan sopp-mikrobielle interaksjoner overvåkes i kontrollerte fysisk-kjemiske miljøer med høyere temporal og romlig oppløsning enn tidligere mulig. Anvendelsen av disse verktøyene har gitt en rekke nye biologiske innsikter, for eksempel observasjon av bakteriell polar tilknytning til hyphae eller avsløre ukarakteriserte sopp-sopp antagonismer. Et sentralt trekk ved disse metodene anser brukervennligheten av dette verktøyet av ikke-eksperter, noe som gir svært overførbare teknologier for bruk i mikrobiologilaboratorier.

Representative resultater presenteres fra de eksemplariske BFI40- og FFI41-enhetene. Hyphal vekstratemålinger kan enkelt oppnås ved hjelp av disse enhetene i kombinasjon med grunnleggende mikroskopiteknikker. Figur 3A-B illustrerer bakteriell-sopp interaksjoner mellom C. cinerea hyphae og B. subtilis NCIB 3610. Tilstedeværelsen av B. subtilis stopper veksten av C. cinerea ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

På grunn av jordens opasitet kan interaksjoner mellom dens bestanddeler ikke lett visualiseres med cellulær oppløsning. Her presenteres to mikrofluidiske verktøy, som gir nye muligheter for å undersøke sopp-mikrobielle interaksjoner. Enhetene er allsidige og enkle å bruke, noe som muliggjør høy romlig kontroll og høyoppløselig bildebehandling på mobilnivå.

Mikrofluidiske verktøy for probing av sopp-mikrobielle interaksjoner på cellenivå

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Ved hjelp av de presenterte mikrofluidiske enhetene kan vi undersøke dynamiske interaksjoner mellom sopp og andre mikrober med presis spacial og miljøkontroll, samt høyoppløselig avbildning på enkeltcellenivå. Det er viktig at soppveksten begrenses og styres innenfor den mikrofluidiske kanalen. Gjør det mulig å hente bilder av høy kvalitet.Derfor kan kompleksiteten i sopp-sopp- og soppbakterielle interaksjoner utforskes. Å forstå soppmikrobielle interaksjoner er et viktig skritt i å definere og bevare jordmikrobiomet. Denne kunnskapen kan utnyttes til utvikling av nye biokontrollagenter med bærekraftig landbruk.Til å begynne med, forberede ca 40 gram poly (dimetylsiloksan) eller PDMer, ved å blande basen og herdemiddelet grundig i et 10 til 1 forhold ved hjelp av en spatel i en ren plastkopp. For å fjerne alle luftbobler, plasser koppen i et vakuumkammer i en time. Deretter, ved hjelp av klar tape, fest masterformen i en plastbrakett og bruk trykkfiltrert luft for å fjerne støvpartikler, hell deretter PDM-ene på midten av mesterformen og la den slå seg ned.For å forhindre sedimentering av støvpartikler på PDMs overflate, dekk mesterformen løst med et plastlokk, overfør deretter mesterformen til en ovn og herd over natten ved 70 grader Celsius. Etter å ha fjernet masterformen fra ovnen og latt den avkjøles, skrell de herdede PDMene bort fra mesterformen og plastrammen uten å skade mesterformen i PDM-ene. For å opprettholde en støvfri overflate, plasser deretter klart tape over mikrokanalene som er preget inn i PDMene.Deretter bruker du en montert giljotin eller et barberblad for å kutte PDM-ene i plater som angitt av designet. Når du kutter sideåpningen på PDMs-platen som brukes til bakteriell soppinteraksjonsenhet, eller BFI-enhet, må du sørge for at mikrokanalene er helt åpne. Men for PDMs plater som brukes i monteringen av sopp-sopp interaksjonsenheten, eller FFI, bør hvert hjørne trimmes slik at det passer inn i en glassbunn Petri-tallerken.Deretter bruker du en presisjonskutter til å stanse innløps- eller utløpshull i henhold til enhetens design. Deretter senker du PDMs plater ned i en 0,5 molar natriumhydroksidoppløsning. Skyll platene i sterilt dobbelt destillert vann før du overfører dem til en 70% etanoloppløsning.Etter å ha fjernet etanol og skyllet platene med dobbelt destillert sterilt vann igjen, senk platene i sterilt dobbelt destillert vann og soniker i fem minutter, fjern deretter PDMs plate fra vannet, tørk dem med trykkfiltrert luft og legg dem i en steril firkantet Petri-tallerken. Deretter inkuber petri parabolen med PDMs plate i en ovn på 70 grader Celsius i en time. Når platene er avkjølt i et støvfritt miljø, må du fjerne støv fra overflaten ved hjelp av tape og trykkfiltrert luft.For å aktivere overflatene på PDMs plater og glassbunn Petri-retter, som deretter bindes sammen, plasser dem i en plasmarenser med overflatene som skal aktiveres vendt oppover. Etter å ha fjernet PDMs-platen i Petri-rettene fra plasmarenseren, kan du binde dem forsiktig ved å plassere de aktiverte overflatene i samsvar med hverandre. Bond BFI og FFI PDMs plate med Petri retter på henholdsvis 35 millimeter og 55 millimeter diameter, henholdsvis for å sjekke vellykket binding, prøv å trekke PDMs lab av sin Petri parabolen med pinsett.Visualiser enheten nøye med øyet eller ved generisk mikroskopi for å sikre at inokulasjonsinntakene eller mikrokanalene ikke kollapser. For vannmettede eller næringsrike forhold, pipette 100 mikroliter av ønsket løsning for å fylle BFI-enheter umiddelbart etter binding. For FFI-enheter legger du til 30 mikroliter av mediet i hvert innløp.Til slutt legger du til 100 til 200 mikroliter sterilt dobbelt destillert vann til Petri-parabolen for å opprettholde fuktighet. Men for vann umettede forhold, bare tilsett 100 til 200 mikroliter sterilt dobbelt destillert vann til Petri-parabolen for å opprettholde fuktighet. For soppinokulering, inne i en laminær strømningshette, ved hjelp av en sterilisert korkborer, fjern en agarplugg fra en koloni i periferien av en tre dager gammel kultur, og sørg for å holde den voksende hyphalfronten intakt.Sett deretter agarpluggen inn i soppinntaket på BFI- og/eller FFI-enheten med myceliumsiden ned i hyphalfronten orientert mot mikrokanalåpningene for å oppmuntre til hyphalinfiltrasjon av kanalene. For FFI-enheten, introduser en annen agarplugg med en annen soppart i motsatt innløp. Deretter forsegler petriskålen med en gjennomsiktig film og inkuberer på 25 til 28 grader Celsius i mørket til avbildning.For bakteriell inokulering, etter fjerning av BFI-enheten fra inkubatoren, pipetter 10 mikroliter av en bakteriell suspensjon i bakterieinntaket i et sterilt miljø. Når Petri-parabolen er forseglet med en gjennomsiktig film, lagres enheten oppreist på 25 grader Celsius i mørket til avbildningen begynner. Ved hjelp av denne protokollen kan samspillet mellom sopp coprinopsis cinerea og bakterien Bacillus subtilis visualiseres.Det ble observert at i nærvær av bakterien begynte vekstraten av soppen å avta drastisk etter omtrent fem timer med myntokulasjon. Videre hadde sopphyfasen forbundet med bakteriene et tynt og gjennomsiktig utseende. Tidsforløp fluorescensmikroskopi avslørte også sopphyphaekollaps etter fem timer med myntokulering med Bacillus subtilis.Men fra seks timer og utover begynte bakteriepopulasjonen også å avta. Visualisering av sopp-sopp interaksjoner viste at Fusarium graminearum sterkt hemmet veksten av Trichoderma rossicum, som var tydelig ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Denne protokollen avslørte videre betydelige morfologiske endringer i soppen Verticillium longisporum i nærvær av bakterier Pseudomonas synxantha og Pseudomonas fluorescens.Den dynamiske bildeteknikken med høy oppløsning som ble brukt i studien, avslørte også septadannelse i Fusarium graminearum i nærvær av soppen Clonostachys rosea. Fluorescensmerking ga dynamisk kvantifisering av Clonostachys rosea hyphalproliferasjon i FFI-enheten. Disse enhetene kan tilpasses og modifiseres av brukeren for å innlemme ulike arter av interesse og adressere deres spesifikke eksperimentelle spørsmål om soppmikrobielle interaksjoner.Både BFI- og FFI-enhetene har presset vitenskapelige grenser, og avslørt hvordan sopp forplanter forsvarssignaler og næringsstoffer ved angrep av sopp, virus, nematoder og muliggjøre undersøkelser om bakteriell spredning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Heft frekvens analyse for In Situ Kinetics Analyse av Cross-junctional molekylære interaksjoner på Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase aktivitet på subcellulære nivå og på Tidsskala sekunder i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastsettelse av Transport Valuta xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjelp<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelig placentaperfusjon Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ og Temporal Kontroll av Oxygen mikromiljøet på Single Holme nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur of Living mikrobiomer med mikro-oppbygd Menneskelig tarmtotter i en Gut-on-a-Chip mikrofluid Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Designing mikrofluid Enheter for å studere cellulære responser Under Singel eller andre sykdoms Kjemisk / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikrofluidsystem med Surface Mønstring for Gransker Kavitasjon Bubble (e)-celle Samhandling og den resulterende bioeffekter på Single-cellenivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...