Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Reconhecemos o apoio financeiro do Departamento de Bioengenharia do Imperial College London e do Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

NOTA: Um resumo dos procedimentos descritos neste protocolo são visualmente retratados na Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática da metodologia apresentada consistindo de cinco seções principais detalhadas neste protocolo. Os projetos dos dispositivos são criados usando o softwa...

Este artigo apresenta um protocolo para o estudo das interações fúngicos-microbianas utilizando microfluidos de canal. Os autores visam demonstrar a versatilidade desses dispositivos e incentivar a adaptação para atender aos interesses do pesquisador. Usando os dispositivos BFI e FFI exemplares, as interações fúngicos-microbianas podem ser estudadas com mais detalhes do que previamente acessíveis. Ao remover a complexidade de fundo e a heterogeneidade do solo, moderando o crescimento da hifa de tal forma que ele...

O solo é um ambiente excepcionalmente diverso que contém uma abundância de microrganismos que são instrumentais para os ciclos de carbono e fósforo 1,2. Os fungos filamentosos são um componente importante de inúmeros ecossistemas como decomposição de matéria orgânica e inorgânica e podem melhorar a nutrição das plantas através da formação de relações simbióticas 3,4. Dentro do solo, os fungos interagem dinamicamente com uma infinidade de micróbios como outros fungos5, bactérias6, vírus7 e nematoides8. Essas interações têm consequências significativas para a saúde do solo e das plantas. No entanto, devido à falta de sistemas experimentais apropriados capazes de imagens interagindo microrganismos com alta resolução, muitos permanecem indefinidos.
Investigações relativas às interações bacteriana-fúngica (BFIs) e interações fúngicas (FFIs) têm aplicações valiosas em uma variedade de campos, incluindo antimicrobianos na medicina e agentes de controle biológico na agricultura. Por exemplo, o fungo Coprinopsis cinerea produz o peptídeo copsin, que tem sido mostrado para exibir atividade antibacteriana contra o patógeno humano Listeria monocytogenes9. Da mesma forma, o composto derivado de fungos, griseofulvin, é amplamente utilizado como tratamento para infecções fúngicas humanas e é adicionalmente capaz de inibir o crescimento do fungo patogênico da planta Alternaria solani10,11. Várias cepas da bactéria bacillus subtilis também foram demonstradas como agentes de biocontrole eficazes do patógeno fúngico da planta Rizoctonia solani12,13. No entanto, devido às limitações associadas às metodologias tradicionais, os BFIs e os FFIs são mal compreendidos ao nível de células únicas.
Estudos convencionais normalmente exploram BFIs e FFIs na macroescala usando placas de ágar com duas ou mais espécies em confronto. Sua interação é avaliada pela medição das taxas de crescimento e produção metabólica das espécies confrontantes 14,15,16; no entanto, essa metodologia só é resolvida ao nível da colônia. Para estudar interações no nível celular, inoculantes bacterianos e fúngicos podem ser cultivados em lâminas de microscópio de vidro revestidas com ágar que são então imagens sob um microscópio17. No entanto, pode ser difícil seguir uma única higifia usando slides de microscópio devido à falta de confinamento, o que significa que imagens com lapso de tempo são mais difíceis de obter. Além disso, a oportunidade de confinar espacialmente outros microrganismos dentro de regiões definidas do micélio fúngico ou criar ambientes químicos definidos que podem ser perturbados, por exemplo, não é possível nessas configurações. A natureza "caixa preta" do solo também aumenta a complexidade de estudar interações fúngicos-microbianas ao nível de células únicas18. Observando espécies interagindo longe da incrível diversidade do microbioma do solo, a maneira exata pela qual os membros interagem pode ser avaliada. Assim, há uma necessidade contínua de plataformas versáteis que permitem imagens unicelulares de alta resolução de BFIs e FFIs.
As tecnologias microfluídicas, os chamados sistemas lab-on-a-chip, fornecem uma plataforma ideal para o estudo de BFIs e FFIs ao nível de células únicas. O campo dos microfluidos, originários de tecnologias desenvolvidas para análise química e microeletrônica, tem sido adotado pelas ciências biológicas19. As tecnologias microfluidas regulam pequenos volumes de fluidos dentro de uma rede sob medida de canais miniaturizados, tendo pelo menos uma dimensão na escala de micromítre, e seu uso em pesquisas biológicas está expandindo20. Em particular, foram desenvolvidos dispositivos microfluidos para examinar o crescimento de fungos filamentosos 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Um benefício do uso dessa tecnologia é que o confinamento da hifa e a distribuição de nutrientes dentro dos microcanais se assemelham mais à estrutura do ambiente do solo do que os métodos convencionais de ágar31. Recentemente, plataformas microfluidas têm sido usadas para investigar interações entre neutrófilos humanos e patógenos fúngicos32, bactérias e raízes vegetais33, além de fungos e nematoides34,35.
Uma das muitas vantagens do uso de microfluidos para o estudo de interações microbianas inclui o controle específico do ambiente microcanal. Por exemplo, regimes de fluxo laminar podem ser explorados para gerar gradientes de concentração definidos, o que é especialmente útil ao examinar a quimiotaxis bacteriana36. Outra vantagem é que a natureza transparente do poli(dimetilsiloxano) (PDMS), um polímero elastomérico barato e biocompatível comumente utilizado na fabricação de dispositivos microfluidos, facilita a imagem de alta resolução de células únicas usando microscopia de campo brilhante e fluorescência37. Da mesma forma, o confinamento de micróbios dentro de microcanais significa que experimentos de lapso de tempo que rastreiam células únicas podem ser realizados, permitindo que respostas celulares individuais sejam registradas e quantificadas37. Por fim, como os dispositivos microfluidos podem ser projetados para serem fáceis de usar, eles podem ser facilmente empregados por não-especialistas38.
O aprofundamento do conhecimento das interações entre microrganismos que habitam o solo é importante para melhorar as práticas sustentáveis de manejo do ecossistema que mantêm a biodiversidade e mitigar o impacto das mudanças climáticas nos ambientes terrestres39. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas microfluídicas é fundamental para ampliar a compreensão dos fungos e suas interações no nível celular. O protocolo aqui se concentrará em dois dispositivos microfluidos produzidos para o estudo das BFIs40 e FFIs41, representadas na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figura 1: Representação visual e esquemática dos dispositivos de interação bacteriana-fúngica (BFI) e interação fúngico (FFI). Um plugue mycelial é colocado na entrada de uma extremidade dos microcanais para permitir o crescimento de hifas no dispositivo. A entrada bacteriana está na extremidade oposta. Barra de escala = 5 mm. (B) Visão geral esquemática do dispositivo BFI, representando o posicionamento das entradas bacterianas e a direção do crescimento hifál através dos microcanais de interação. Os canais têm 10 μm de profundidade, 100 μm de largura e 7 mm de comprimento, com 28 canais de observação no total. (C) Ensaio de confronto na placa de ágar entre Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610, barra de escala = 20 mm (esquerda). Imagens de microscopia mostrando a interação entre C. cinerea e B. subtilis NCIB 3610 dentro do microcanal (médio e direito), ou seja, fixação polar de bactérias à hifa fúngica. Barra de escala = 25 μm (médio) e 10 μm (direita). (D) Imagem do dispositivo FFI ligado a uma placa de Petri com fundo de vidro, duplamente inoculada com plugues miceliais. Barra de escala = 1 cm. (E) Visão geral esquemática do dispositivo FFI. Dois plugues inoculantes fúngicos são introduzidos nas entradas em cada extremidade do dispositivo, permitindo a exploração higfálica dos microcanais. Os canais de controle são conectados apenas a uma entrada fúngica e têm um canal sem saída, impedindo interações entre os fungos de teste. Os canais de interação conectam ambas as entradas fúngicas e permitem interações hifais entre os sujeitos do teste dentro do microcanal. Cada canal de interação consiste em 18 seções em forma de diamante, medindo um comprimento total de 8,8 mm (490 x 430 μm por diamante), 10 μm de profundidade e tendo uma região de conexão entre cada diamante de 20 μm. Os tipos de canal são duplicados, barras de escala = 1 mm. (F) Zona de interação entre duas frentes hifais que se aproximam, crescendo a partir de extremidades opostas do canal de interação interconectada. Imagem de microscopia de contraste de fase, barra de escala = 250 μm. Os painéis desta figura foram modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 e Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Os fungos filamentosos são habitantes bem sucedidos do solo e desempenham um papel importante nos ecossistemas do solo, como na decomposição da matéria orgânica e inorgânica, bem como na regulação dos níveis de nutrientes. Lá eles também encontram inúmeras oportunidades de interagir com uma variedade de outros micróbios, como bactérias ou outros fungos. Estudar interações fúngicas no nível celular, no entanto, pode ser desafiador devido à natureza do solo semelhante à caixa preta. Novas ferramentas microfluídicas estão sendo desenvolvidas para o estudo das interações fúngicas; duas plataformas projetadas para estudar interações bacteriana-fúngicas e fúngicas são destacadas. Dentro desses microcanais, as interações fúngicos-microbianas podem ser monitoradas em ambientes físico-químicos controlados em maior resolução temporal e espacial do que antes possível. A aplicação dessas ferramentas tem rendido inúmeros novos insights biológicos, como a observação do apego polar bacteriano à hifa ou a revelação de antagonismos fúngicos-fúngicos não característicos. Uma característica fundamental dessas metodologias considera a facilidade de uso desta ferramenta por não especialistas, produzindo tecnologias altamente traduzíveis para uso em laboratórios de microbiologia.

Os resultados representativos são apresentados dos dispositivos BFI40 eFFI 41 exemplares. As medidas da taxa de crescimento hiphal podem ser facilmente obtidas usando esses dispositivos em combinação com técnicas básicas de microscopia. A Figura 3A-B ilustra interações bacteriana-fúngicas entre C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. A presença de B. subtilis interrompe o ...

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Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Utilizando os dispositivos microfluidos apresentados, podemos examinar interações dinâmicas entre fungos e outros micróbios com controle espacial e ambiental preciso, bem como imagens de alta resolução no nível único celular. É importante ressaltar que o crescimento fúngico pode ser confinado e direcionado dentro do canal microfluido. Permitindo a obtenção de imagens de lapso de tempo de alta qualidade.Portanto, as complexidades das interações fúngica-fúngicas e fúngicas podem ser exploradas. Compreender as interações microbianas fúngicas é um passo essencial na definição e preservação do microbioma do solo. Esse conhecimento pode ser explorado para o desenvolvimento de novos agentes de biocontrole com agricultura sustentável.Para começar, prepare aproximadamente 40 gramas de poli (dimetilsiloxano)ou PDMs, misturando completamente a base e o agente de cura em uma proporção de 10 a 1 usando uma espátula em um copo plástico limpo. Para remover todas as bolhas de ar, coloque o copo em uma câmara de vácuo por uma hora. Em seguida, usando fita transparente, fixar o molde mestre em um suporte plástico e usar ar filtrado comprimido para remover quaisquer partículas de poeira, em seguida, despeje os PDMs no centro do molde mestre e deixe-o assentar.Para evitar o assentar partículas de poeira na superfície dos PDMs, cubra livremente o molde mestre com uma tampa plástica, depois transfira o molde mestre para um forno e cure durante a noite a 70 graus Celsius. Depois de remover o molde mestre do forno e permitir que ele esfrie, descasque os PDMs curados longe do molde mestre e da estrutura plástica sem danificar o molde mestre nos PDMs. Em seguida, para manter uma superfície livre de poeira, coloque fita clara sobre os microcanais gravados nos PDMs.Em seguida, use uma guilhotina montada ou uma lâmina de barbear para cortar os PDMs em lajes conforme designado pelo design. Ao cortar a abertura lateral da laje PDMs usada para o dispositivo de interação bacteriana-fúngica, ou dispositivo BFI, certifique-se de que os microcanais estejam totalmente abertos. No entanto, para as lajes PDMs usadas na montagem do dispositivo de interação fúngico-fúngico, ou FFI, cada canto deve ser aparado para que ele se encaixe em uma placa de Petri de fundo de vidro.Em seguida, use um cortador de precisão para perfurar furos de entrada ou saída de acordo com o design do dispositivo. Em seguida, submergir as lajes dos PDMs em uma solução de hidróxido de sódio molar de 0,5. Enxágüe as lajes em água destilada dupla estéril antes de transferi-las para uma solução de 70% de etanol.Depois de remover o etanol e enxaguar as lajes com água estéril duplamente destilada novamente, imergir as lajes em água estéril dupla destilada e sonicato por cinco minutos, em seguida, remova a laje dos PDMs da água, seque-as com ar filtrado comprimido e coloque-as em uma placa de Petri quadrada estéril. Em seguida, incubar a placa de Petri com laje PDMs em um forno a 70 graus Celsius por uma hora. Uma vez que as lajes tenham esfriado em um ambiente livre de poeira, limpe qualquer poeira de sua superfície usando fita adesiva e ar filtrado comprimido.Para ativar as superfícies das lajes dos PDMs e das placas de Petri de fundo de vidro, que serão posteriormente unidas, coloque-as em um limpador de plasma com as superfícies a serem ativadas voltadas para cima. Depois de remover a laje de PDMs nas placas de Petri do limpador de plasma, uni-los suavemente colocando as superfícies ativadas em contato conformal entre si. Bond BFI e FFI PDMs laje com placas de Petri de 35 milímetros e 55 milímetros de diâmetro, respectivamente para verificar a ligação bem sucedida, tente puxar o laboratório PDMs de sua placa de Petri com pinças.Visualize o dispositivo cuidadosamente com o olho ou por microscopia genérica para garantir que não haja colapso das entradas ou microcanais. Para condições saturadas de água ou ricas em nutrientes, pipeta 100 microlitres da solução desejada para encher dispositivos BFI imediatamente após a ligação. Para dispositivos FFI, adicione 30 microliters da mídia em cada entrada.Por fim, adicione 100 a 200 microliters de água dupla destilada estéril à placa de Petri para manter a umidade. No entanto, para condições insaturadas de água, basta adicionar 100 a 200 microliters de água dupla estéril destilada à placa de Petri para manter a umidade. Para a inoculação fúngica, dentro de uma coifa de fluxo laminar, usando um borer de cortiça esterilizado, remova um plugue de ágar de uma colônia na periferia de uma cultura de três dias de idade, garantindo manter intacta a frente de hignêquico em crescimento.Em seguida, introduza o plugue de ágar na entrada fúngica do dispositivo BFI e/ou FFI com o lado micélio para baixo na frente hiphal orientada para as aberturas microcanais para incentivar a infiltração hifal dos canais. Para o dispositivo FFI, introduza outro plugue de ágar com uma segunda espécie fúngica na entrada oposta. Em seguida, sele a placa de Petri com um filme transparente e incubar a 25 a 28 graus Celsius no escuro até a imagem.Para a inoculação bacteriana, após a remoção do dispositivo BFI da incubadora, pipeta 10 microliters de uma suspensão bacteriana na entrada bacteriana em um ambiente estéril. Uma vez que a placa de Petri é selada com uma película transparente, armazenado o dispositivo ereto a 25 graus Celsius no escuro até que a imagem comece. Usando este protocolo, a interação entre o fungo Coprinopsis cinerea e a bactéria Bacillus subtilis poderia ser visualizada com sucesso.Observou-se que, na presença da bactéria, a taxa de crescimento do fungo começou a diminuir drasticamente após cerca de cinco horas de coinoculação. Além disso, a hifa fúngica associada à bactéria tinha uma aparência fina e transparente. A microscopia de fluorescência de lapso de tempo também revelou o colapso da hifafángica após cinco horas de coinoculação com iciclismo bacillus.No entanto, a partir de seis horas, a população bacteriana também começou a declinar. A visualização das interações fúngicas-fúngicas mostrou que o fusarium graminearum inibiu fortemente o crescimento do Trichoderma rossicum, que ficou evidente usando microscopia de fluorescência. Este protocolo revelou ainda mudanças morfológicas significativas no fungo Verticillium longisporum na presença das bactérias Pseudomonas synxantha e Pseudomonas fluorescens.A técnica de imagem dinâmica de alta resolução utilizada no estudo também revelou a formação de septa no Fusarium graminearum na presença do fungo Clonostachys rosea. A rotulagem de fluorescência proporcionou a quantificação dinâmica de Clonostachys rosea hyphal proliferação no dispositivo FFI. Esses dispositivos podem ser adaptados e modificados pelo usuário para incorporar diferentes espécies de interesse e abordar suas questões experimentais específicas sobre interações microbianas fúngicas.Tanto os dispositivos BFI quanto FFI têm empurrado fronteiras científicas, revelando como os fungos propagam sinais de defesa e nutrientes após ataque de fungos, vírus, nematoides e permitindo investigações sobre dispersão bacteriana.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...