Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Мы признаем финансовую поддержку со стороны Департамента биоинженерии Имперского колледжа Лондона и The Leverhulme Trust (ссылка на исследовательский грант: RPG-2020-352).

ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое изложение процедур, описанных в этом протоколе, визуально показано на рисунке 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематическое представление представленной методоло?...

В данной статье представлен протокол исследования грибково-микробных взаимодействий с использованием канальной микрофлюидики. Авторы стремятся продемонстрировать универсальность этих устройств и поощрять адаптацию в соответствии с интересами исследователя. Используя примерные у?...

Почва представляет собой исключительно разнообразную среду, содержащую обилие микроорганизмов, которые играют важную роль в углеродных и фосфорных циклах 1,2. Нитевидные грибы являются основным компонентом многочисленных экосистем в качестве разлагателей органического и неорганического вещества и могут усиливать питание растений путем формирования симбиотических отношений 3,4. В почве грибы динамически взаимодействуют с множеством микробов, таких как другие грибы5, бактерии6, вирусы7 и нематоды8. Эти взаимодействия имеют значительные последствия для здоровья почвы и растений. Тем не менее, из-за отсутствия соответствующих экспериментальных систем, способных визуализировать взаимодействующие микроорганизмы с высоким разрешением, многие из них остаются неопределенными.
Исследования, касающиеся бактериально-грибковых взаимодействий (BFI) и грибково-грибковых взаимодействий (FFI), имеют ценное применение в целом ряде областей, включая противомикробные препараты в медицине и агенты биологического контроля в сельском хозяйстве. Например, гриб Coprinopsis cinerea продуцирует пептид копсин, который, как было показано, проявляет антибактериальную активность против патогена человека Listeria monocytogenes9. Аналогичным образом, грибковое соединение, гризеофульвин, широко используется в качестве лечения грибковых инфекций человека и дополнительно способно ингибировать рост растительного патогенного гриба Alternaria solani10,11. Было также продемонстрировано, что несколько штаммов почвенной бактерии Bacillus subtilis являются эффективными агентами биоконтроля грибкового патогена растений Rhizoctonia solani12,13. Тем не менее, из-за ограничений, связанных с традиционными методологиями, BFI и FFI плохо понимаются на уровне одиночных клеток.
Обычные исследования обычно исследуют BFI и FFI на макроуровне с использованием агаровых пластин с двумя или более видами в противостоянии. Их взаимодействие оценивается путем измерения темпов роста и выработки метаболитов противостоящих видов 14,15,16; однако эта методология распространяется только на колониальный уровень. Для изучения взаимодействий на клеточном уровне бактериальные и грибковые инокулянты могут культивироваться на предметных стеклах микроскопа, покрытых агаром, которые затем визуализируются под микроскопом17. Тем не менее, может быть трудно проследить за одной гифой с помощью слайдов микроскопа из-за отсутствия удержания, что означает, что покадровые изображения труднее получить. Кроме того, возможность пространственно ограничивать другие микроорганизмы в пределах определенных областей грибкового мицелия или создавать определенные химические среды, которые могут быть нарушены, например, невозможна в таких установках. Характер почвы «черного ящика» также усложняет изучение грибково-микробных взаимодействий на уровне одиночных клеток18. Наблюдая за взаимодействующими видами вдали от невероятного разнообразия почвенного микробиома, можно оценить точный способ взаимодействия отдельных членов. Таким образом, сохраняется потребность в универсальных платформах, которые обеспечивают одноклеточную визуализацию BFI и FFI с высоким разрешением.
Микрофлюидные технологии, так называемые системы lab-on-a-chip, обеспечивают идеальную платформу для изучения BFI и FFI на уровне одиночных клеток. Область микрофлюидики, происходящая из технологий, разработанных для химического анализа и микроэлектроники, была принята биологическими науками19. Микрофлюидные технологии регулируют небольшие объемы жидкостей в специальной сети миниатюрных каналов, имеющих по меньшей мере одно измерение в микрометровом масштабе, и их использование в биологических исследованиях расширяется20. В частности, разработаны микрофлюидные устройства для изучения роста нитевидных грибов 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Одним из преимуществ использования этой технологии является то, что ограничение гиф и распределение питательных веществ в микроканалах более близко напоминает структуру почвенной среды, чем обычные агаровые методы31. В последнее время микрофлюидные платформы используются для исследования взаимодействий между нейтрофилами человека и грибковыми патогенами32, бактериями и корнями растений33, а также грибами и нематодами34,35.
Одним из многих преимуществ использования микрофлюидики для изучения микробных взаимодействий является специфический контроль микроканальной среды. Например, ламинарные режимы потока могут быть использованы для генерации определенных градиентов концентрации, что особенно полезно при исследовании бактериального хемотаксиса36. Другим преимуществом является то, что прозрачная природа поли(диметилсилоксана) (PDMS), недорогого, биосовместимого эластомерного полимера, обычно используемого при изготовлении микрофлюидных устройств, облегчает визуализацию одиночных клеток с высоким разрешением с использованием ярко-полевой и флуоресцентной микроскопии37. Аналогичным образом, ограничение микробов в микроканалах означает, что могут быть проведены покадровые эксперименты, отслеживающие отдельные клетки, позволяющие регистрировать и количественно оценивать отдельные клеточные ответы37. Наконец, поскольку микрофлюидные устройства могут быть спроектированы так, чтобы быть удобными для пользователя, они могут быть легко использованы неспециалистами38.
Углубление знаний о взаимодействии между почвенными микроорганизмами имеет важное значение для совершенствования практики устойчивого управления экосистемами, которая поддерживает биоразнообразие и смягчает воздействие изменения климата на наземную среду39. Таким образом, разработка новых микрофлюидных инструментов имеет основополагающее значение для расширения понимания грибов и их взаимодействий на клеточном уровне. Протокол здесь будет сосредоточен на двух микрофлюидных устройствах, произведенных для изучения BFI40 и FFI41, как показано на рисунке 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Рисунок 1: Визуальное и схематическое представление устройств бактериально-грибкового взаимодействия (BFI) и грибково-грибкового взаимодействия (FFI). (A) Изображение устройства BFI. Мицелиальная пробка размещается на входе в один конец микроканалов, чтобы обеспечить рост гифы в устройстве. Бактериальное входное отверстие находится на противоположном конце. Шкала = 5 мм. (B) Схематический обзор устройства BFI, изображающий позиционирование бактериальных входов и направление роста гифаля через микроканал взаимодействия. Каналы имеют глубину 10 мкм, ширину 100 мкм и длину 7 мм, всего 28 каналов наблюдения. (C) Анализ противостояния на агаровой пластине между Coprinopsis cinerea и Bacillus subtilis NCIB 3610, шкала бар = 20 мм (слева). Микроскопические изображения, показывающие взаимодействие между C. cinerea и B. subtilis NCIB 3610 в пределах микроканала (средний и правый), т. е. полярное прикрепление бактерий к грибковым гифам. Шкала стержня = 25 мкм (посередине) и 10 мкм (справа). (D) Изображение устройства FFI, прикрепленного к чашке Петри со стеклянным дном, двойной инокулированной мицелиальными пробками. Шкала = 1 см. (E) Схематический обзор устройства FFI. Две заглушки грибкового инокулянта вводятся во входные отверстия на обоих концах устройства, что позволяет гифальное исследование микроканалов. Контрольные каналы соединены только с одним грибковым входом и имеют тупиковый канал, предотвращая взаимодействие между тестовыми грибами. Каналы взаимодействия соединяют оба грибковых входа и позволяют гифальные взаимодействия между испытуемыми в микроканале. Каждый канал взаимодействия состоит из 18 алмазообразных секций, общей длиной 8,8 мм (490 x 430 мкм на алмаз), глубиной 10 мкм и имеющих соединительную область между каждым алмазом 20 мкм. Типы каналов дублируются, шкала баров = 1 мм. (F) Зона взаимодействия между двумя приближающимися гифальными фронтами, растущая с противоположных концов взаимосвязанного канала взаимодействия. Изображение фазово-контрастной микроскопии, шкала = 250 мкм. Панели на этом рисунке были изменены из Stanley et al., 2014 (A-C)40 и Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Нитевидные грибы являются успешными обитателями почвы и играют важную роль в почвенных экосистемах, таких как разложение органических и неорганических веществ, а также регулирование уровня питательных веществ. Там они также находят многочисленные возможности для взаимодействия с множеством других микробов, таких как бактерии или другие грибы. Однако изучение грибковых взаимодействий на клеточном уровне может быть сложной задачей из-за черной коробчатой природы почвы. Разрабатываются новые микрофлюидные инструменты для изучения грибковых взаимодействий; выделены две платформы, предназначенные для изучения бактериально-грибковых и грибково-грибковых взаимодействий. В этих микроканалах грибковые и микробные взаимодействия могут контролироваться в контролируемых физико-химических средах с более высоким временным и пространственным разрешением, чем это было возможно ранее. Применение этих инструментов дало многочисленные новые биологические идеи, такие как наблюдение бактериальной полярной привязанности к гифам или выявление нехарактеризованных грибково-грибковых антагонизмов. Ключевой особенностью этих методологий является простота использования этого инструмента неспециалистами, что дает высокопереводимые технологии для использования в микробиологических лабораториях.

Репрезентативные результаты представлены из примерных устройств BFI40 и FFI41. Измерения скорости роста гифрагмы могут быть легко получены с помощью этих устройств в сочетании с основными методами микроскопии. Рисунок 3A-B иллюст?...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Из-за непрозрачности почвы взаимодействия между составляющими ее микробами не могут быть легко визуализированы с клеточным разрешением. Здесь представлены два микрофлюидных инструмента, которые открывают новые возможности для исследования грибково-микробных взаимодействий. Устройства универсальны и просты в использовании, обеспечивая высокий пространственно-временный контроль и визуализацию с высоким разрешением на клеточном уровне.

Микрофлюидные инструменты для зондирования грибковых и микробных взаимодействий на клеточном уровне

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Используя представленные микрофлюидные устройства, мы можем исследовать динамические взаимодействия между грибами и другими микробами с точным пространственным и экологическим контролем, а также визуализацией высокого разрешения на уровне одной клетки. Важно отметить, что грибковый рост может быть ограничен и направлен в микрофлюидный канал. Позволяет получать высококачественные покадровые изображения.Поэтому можно исследовать сложности грибково-грибковых и грибко-бактериальных взаимодействий. Понимание взаимодействия грибковых микробов является важным шагом в определении и сохранении почвенного микробиома. Эти знания могут быть использованы для разработки новых агентов биоконтроля с устойчивым сельским хозяйством.Для начала приготовьте примерно 40 граммов поли(диметилсилоксана) или ПДМ, тщательно перемешав основание и отверждающий агент в соотношении 10 к 1 с помощью шпателя в чистом пластиковом стаканчике. Чтобы удалить все пузырьки воздуха, поместите чашку в вакуумную камеру на один час. Затем, используя прозрачную ленту, закрепите основную форму в пластиковом креплении и используйте сжатый фильтрованный воздух для удаления любых частиц пыли, затем вылейте PDM на центр главной формы и дайте ей осесть.Чтобы предотвратить оседание частиц пыли на поверхности PDM, неплотно накройте основную форму пластиковой крышкой, затем перенесите основную форму в духовку и отверждайте на ночь при 70 градусах Цельсия. После удаления основной формы из духовки и дать ей остыть, отклейте отвержденные ПДН от основной формы и пластиковой рамы, не повредив основную форму в ПДН. Затем, чтобы сохранить поверхность без пыли, поместите прозрачную ленту на микроканалы, выбитые в PDMM.Затем используйте установленную гильотину или лезвие бритвы, чтобы разрезать PDM на плиты, как указано в конструкции. При разрезании бокового отверстия плиты PDM, используемой для устройства бактериально-грибкового взаимодействия или устройства BFI, убедитесь, что микроканалы полностью открыты. Однако для плит PDM, используемых при сборке устройства грибково-грибкового взаимодействия, или FFI, каждый угол должен быть обрезан так, чтобы он помещался в стеклянную чашку Петри.Затем используйте прецизионный резак для пробивки входных или выходных отверстий в соответствии с конструкцией устройства. Затем погрузите плиты PDM в 0,5-молярный раствор гидроксида натрия. Промыть плиты в стерильной двойной дистиллированной воде перед переносом их в 70% раствор этанола.После удаления этанола и промывки плит двойной дистиллированной стерильной водой снова, погрузите плиты в стерильную двойную дистиллированную воду и ультразвук на пять минут, затем извлеките плиту PDM из воды, высушите их сжатым фильтрованным воздухом и поместите их в стерильную квадратную чашку Петри. Затем высиживают чашку Петри с плитой PDM в духовке при 70 градусах Цельсия в течение одного часа. После того, как плиты остынут в свободной от пыли среде, очистите их поверхность от пыли с помощью ленты и сжатого фильтрованного воздуха.Чтобы активировать поверхности плит ПДН и стеклянных донных чашек Петри, которые впоследствии будут склеены вместе, поместите их в плазменный очиститель с поверхностями, которые будут активированы, обращенными вверх. После удаления плиты ПДН в чашках Петри из плазмоочистителя аккуратно свяжите их, поместив активированные поверхности в конформный контакт друг с другом. Связуйте плиты BFI и FFI PDM с чашками Петри диаметром 35 миллиметров и 55 миллиметров соответственно для проверки успешного склеивания, попробуйте вытащить лабораторию PDM из своей чашки Петри пинцетом.Тщательно визуализируйте устройство глазом или с помощью общей микроскопии, чтобы обеспечить отсутствие коллапса входных отверстий или микроканалов прививки. Для насыщенных водой или богатых питательными веществами условий пипетка 100 микролитров нужного раствора заполняет BFI приборами сразу после склеивания. Для устройств FFI добавьте 30 микролитров носителя в каждое входное отверстие.Наконец, добавьте от 100 до 200 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды в чашку Петри для поддержания влажности. Однако для ненасыщенных условий воды просто добавьте от 100 до 200 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды в чашку Петри для поддержания влажности. Для прививки грибков внутри ламинарной вытяжки, используя стерилизованный пробковый бур, удалите агаровую пробку из колонии на периферии трехдневной культуры, гарантируя, что растущий гифальный фронт остается нетронутым.Затем вводят агаровую вилку в грибковое отверстие устройства BFI и/или FFI мицелием стороной вниз в гифальной передней части, ориентированной на микроканальные отверстия, чтобы стимулировать гифальную инфильтрацию каналов. Для устройства FFI введите еще одну агаровую пробку со вторым грибковым видом в противоположное входное отверстие. Затем запечатайте чашку Петри прозрачной пленкой и высиживают при температуре от 25 до 28 градусов Цельсия в темноте до получения изображения.Для бактериальной инокуляции, после извлечения устройства BFI из инкубатора, пипетка 10 микролитров бактериальной суспензии в бактериальное входное отверстие в стерильной среде. После того, как чашка Петри запечатана прозрачной пленкой, храните устройство в вертикальном положении при температуре 25 градусов цельсия в темноте до начала визуализации. Используя этот протокол, взаимодействие между грибком Coprinopsis cinerea и бактерией Bacillus subtilis может быть успешно визуализировано.Было замечено, что в присутствии бактерии скорость роста грибка начала резко снижаться примерно через пять часов коинокуляции. Более того, грибковые гифы, связанные с бактериями, имели тонкий и прозрачный вид. Флуоресцентная микроскопия также выявила коллапс грибковых гиф после пяти часов коинокуляции bacillus subtilis.Однако с шести часов бактериальная популяция также начала сокращаться. Визуализация грибково-грибковых взаимодействий показала, что Fusarium graminearum сильно ингибирует рост Trichoderma rossicum, что было очевидно при флуоресцентной микроскопии. Этот протокол дополнительно выявил значительные морфологические изменения в грибе Verticillium longisporum в присутствии бактерий Pseudomonas synxantha и Pseudomonas fluorescens.Метод динамической визуализации высокого разрешения, используемый в исследовании, также выявил образование перегородок в Fusarium graminearum в присутствии гриба Clonostachys rosea. Флуоресцентная маркировка позволила получить динамическую количественную оценку пролиферации гифрала Clonostachys rosea в устройстве FFI. Эти устройства могут быть адаптированы и модифицированы пользователем для включения различных видов, представляющих интерес, и решения их конкретных экспериментальных вопросов, касающихся грибковых микробных взаимодействий.Устройства BFI и FFI раздвинули научные границы, показав, как грибы распространяют защитные сигналы и питательные вещества при нападении грибов, вирусов, нематод и позволяя проводить исследования по рассеиванию бактерий.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Микрожидкостных основе гидродинамической Ловушка для одиночных частиц

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Адгезия частот для пробирной В Ситу Кинетика Анализ кросс-соединительного молекулярных взаимодействий в клетка-клетка интерфейс

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Определение транспортных Оценить ксенобиотиков и наноматериалы через плаценту помощью<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Плацентарной перфузии модели

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Многоступенчатая переменной высоты фотолитографии для Valved Многослойные микрожидком устройств

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...