Name: microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Vi erkänner ekonomiskt stöd från Institutionen för bioteknik vid Imperial College London och The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

OBS: En sammanfattning av de procedurer som beskrivs i detta protokoll visas visuellt i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk representation av den presenterade metoden bestående av fem huvudavsnitt som beskrivs i detta protokoll. Enhetsdesign skapas med hjälp av CAD-programvara (Computer Aided Desi...

Denna artikel presenterar ett protokoll för studier av svamp-mikrobiella interaktioner med hjälp av kanalmikrofluidik. Författarna strävar efter att visa mångsidigheten hos dessa enheter och uppmuntra anpassning för att passa forskarens intressen. Med hjälp av de exemplifierande BFI- och FFI-enheterna kan svamp-mikrobiella interaktioner studeras mer detaljerat än tidigare tillgängligt. Genom att ta bort jordens bakgrundskomplexitet och heterogenitet, moderera tillväxten av hyfer så att de är begränsade till ...

Jord är en exceptionellt varierad miljö som innehåller ett överflöd av mikroorganismer som är avgörande för kol- och fosforcykler 1,2. Trådformiga svampar är en viktig komponent i många ekosystem som sönderdelare av organiskt och oorganiskt material och kan förbättra växternas näring genom bildandet av symbiotiska relationer 3,4. Inom jord interagerar svampar dynamiskt med en mängd mikrober som andra svampar5, bakterier6, virus7 och nematoder8. Dessa interaktioner har betydande konsekvenser för mark- och växthälsa. Men på grund av bristen på lämpliga experimentella system som kan avbilda interagerande mikroorganismer med hög upplösning förblir många odefinierade.
Undersökningar av bakteriell-svampinteraktioner (BFI) och svamp-svampinteraktioner (FFI) har värdefulla tillämpningar inom en rad områden, inklusive antimikrobiella medel inom medicin och biologiska bekämpningsmedel inom jordbruket. Till exempel producerar svampen Coprinopsis cinerea peptiden copsin, som har visat sig uppvisa antibakteriell aktivitet mot den mänskliga patogenen Listeria monocytogenes9. På samma sätt används den svamp-härledda föreningen, griseofulvin, i stor utsträckning som en behandling för mänskliga svampinfektioner och kan dessutom hämma tillväxten av den växtpatogena svampen Alternaria solani10,11. Flera stammar av den jordlevande bakterien Bacillus subtilis har också visat sig vara effektiva biologiska bekämpningsmedel av svampväxtpatogenen Rhizoctonia solani12,13. Icke desto mindre, på grund av begränsningar i samband med traditionella metoder, är BFI och FFI dåligt förstådda på nivån för enskilda celler.
Konventionella studier utforskar vanligtvis BFI och FFI på makroskalan med hjälp av agarplattor med två eller flera arter i konfrontation. Deras interaktion bedöms genom att mäta tillväxthastigheter och metabolitproduktion av de konfronterandearterna 14,15,16; denna metod löses dock endast till koloninivå. För att studera interaktioner på cellnivå kan bakterie- och svampinokulanter odlas på glasmikroskopglas belagda med agar som sedan avbildas under ett mikroskop17. Ändå kan det vara svårt att följa en enda hypha med hjälp av mikroskopglas på grund av brist på inneslutning, vilket innebär att tidsfördröjningsbilder är svårare att få. Vidare är möjligheten att rumsligt begränsa andra mikroorganismer inom definierade regioner i svampmyceliet eller skapa definierade kemiska miljöer som till exempel kan störas inte möjlig i sådana uppsättningar. Jordens "svarta låda" -natur ökar också komplexiteten i att studera svamp-mikrobiella interaktioner på nivån av enskilda celler18. Genom att observera interagerande arter bort från den otroliga mångfalden i jordmikrobiomet kan det exakta sättet på vilket enskilda medlemmar interagerar bedömas. Således finns det ett fortsatt behov av mångsidiga plattformar som möjliggör högupplöst, encellsavbildning av BFI och FFI.
Mikrofluidikteknik, så kallade lab-on-a-chip-system, ger en idealisk plattform för studier av BFI och FFI på nivån av enskilda celler. Området mikrofluidik, som härrör från teknik som utvecklats för kemisk analys och mikroelektronik, har antagits av de biologiska vetenskaperna19. Mikrofluidisk teknik reglerar små volymer vätskor inom ett skräddarsytt nätverk av miniatyriserade kanaler, som har minst en dimension på mikrometerskalan, och deras användning i biologisk forskning expanderar20. I synnerhet har mikrofluidiska anordningar utvecklats för att undersöka tillväxten av trådformiga svampar 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fördel med att använda denna teknik är att inneslutningen av hyfer och fördelningen av näringsämnen inom mikrokanaler mer liknar jordmiljöns struktur än konventionella agarmetoder31. Nyligen har mikrofluidiska plattformar använts för att undersöka interaktioner mellan humana neutrofiler och svamppatogener32, bakterier och växtrötter33, samt svampar och nematoder34,35.
En av de många fördelarna med att använda mikrofluidik för att studera mikrobiella interaktioner inkluderar den specifika kontrollen av mikrokanalmiljön. Till exempel kan laminära flödesregimer utnyttjas för att generera definierade koncentrationsgradienter, vilket är särskilt användbart vid undersökning av bakteriell kemotaxi36. En annan fördel är att den transparenta naturen hos poly(dimetylsiloxan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomer polymer som vanligtvis används vid tillverkning av mikrofluidiska anordningar, underlättar högupplöst avbildning av enskilda celler med användning av ljusfält och fluorescensmikroskopi37. På samma sätt innebär inneslutningen av mikrober i mikrokanaler att time-lapse-experiment som spårar enskilda celler kan utföras, vilket gör att individuella cellulära svar kan registreras och kvantifieras37. Slutligen, eftersom mikrofluidiska enheter kan utformas för att vara användarvänliga, kan de enkelt användas av icke-experter38.
Att öka kunskapen om samspelet mellan marklevande mikroorganismer är viktigt för att förbättra hållbara ekosystemförvaltningsmetoder som upprätthåller den biologiska mångfalden och för att mildra klimatförändringarnas inverkan på landmiljöer39. Således är utvecklingen av nya mikrofluidiska verktyg grundläggande för att utöka förståelsen för svampar och deras interaktioner på cellulär nivå. Protokollet här kommer att fokusera på två mikrofluidiska enheter som produceras för studier av BFI40 och FFI41 som representeras i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figur 1: Visuell och schematisk representation av enheterna för bakteriell-svampinteraktion (BFI) och svamp-svampinteraktion (FFI). En mycelplugg placeras vid ingången till ena änden av mikrokanalerna för att möjliggöra hyphaltillväxt i enheten. Bakterieinloppet är i motsatt ände. Skalstreck = 5 mm. (B) Schematisk översikt över BFI-enheten, som visar placeringen av bakterieinloppen och riktningen för hyphaltillväxt genom interaktionsmikrokanalerna. Kanalerna är 10 μm djupa, 100 μm breda och 7 mm långa, med totalt 28 observationskanaler. (C) Konfrontationsanalys på agarplatta mellan Coprinopsis cinerea och Bacillus subtilis NCIB 3610, skalstreck = 20 mm (vänster). Mikroskopibilder som visar interaktionen mellan C. cinerea och B. subtilis NCIB 3610 inom mikrokanalen (mitten och höger), dvs polär bindning av bakterier till svamphyfer. Skalstreck = 25 μm (mitten) och 10 μm (höger). (D) Bild av FFI-enheten bunden till en glasbottnad petriskål, dubbelinokulerad med mycelproppar. Skalstreck = 1 cm (E) Schematisk översikt över FFI-enheten. Två svampinokutpluggar införs i inloppen i vardera änden av enheten, vilket möjliggör hyphalutforskning av mikrokanalerna. Kontrollkanaler är endast anslutna till ett svampinlopp och har en återvändsgrändskanal, vilket förhindrar interaktioner mellan testsvamparna. Interaktionskanaler förbinder både svampinlopp och tillåter hyphalinteraktioner mellan försökspersonerna inom mikrokanalen. Varje interaktionskanal består av 18 diamantformade sektioner, som mäter en total längd på 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm djup och har ett anslutningsområde mellan varje diamant på 20 μm. Kanaltyper dupliceras, skalstänger = 1 mm. (F) Interaktionszon mellan två närmande hyphalfronter, som växer från motsatta ändar av den sammankopplade interaktionskanalen. Faskontrastmikroskopibild, skalstreck = 250 μm. Panelerna i denna figur har modifierats från Stanley et al., 2014 (A-C)40 och Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11759408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2021</td>
			<td>Autodesk, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave (VX-75)</td>
			<td>Systec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethysilane</td>
			<td>Merck Life Sciences</td>
			<td>386529</td>
			<td>CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>SLS</td>
			<td>COR1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer solution (mr-Dev 600)</td>
			<td>Microresist Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1108</td>
			<td>e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70% v/v)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td>Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for imaging processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered, compressed air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-headed wafer tweezers</td>
			<td>SLS</td>
			<td>INS5026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10008051</td>
			<td>Bent, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1865</td>
			<td>Used for washing of PDMS slabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystallisation dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1866</td>
			<td>Used in the development of master moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass media bottles</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15456113</td>
			<td>e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (Hamilton)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10625251</td>
			<td>Used for dispensing chlorotrimethylsilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (HP 160 III BM)</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>COPA175CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Air Science (PCR)</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar laminar flow hood used for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td>Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode light engine (LedHUB)</td>
			<td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA6 Ultraviolet mask aligner</td>
			<td>Suss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84618</td>
			<td>Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Writer</td>
			<td>Applied Materials</td>
			<td>4700DP</td>
			<td>Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mould plastic mount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D-printed bespoke holder manufactured in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinet&#160; (BioMat2)</td>
			<td>Contained Air Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q purified water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available as standard in biology labs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Free Viewer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar software package for viewing acquired images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (Binder BD115)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15602126</td>
			<td>Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven (CLO-2AH-S)</td>
			<td>KOYO</td>
			<td></td>
			<td>Used for preparing silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>11708573</td>
			<td>120.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15370366</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography mask</td>
			<td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Zepto)</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>100012601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>8323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Semadeni</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable precision balance (OHAUS Scout)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>15519631</td>
			<td>Used for weighing PDMS, media components etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1251135P1183</td>
			<td>Cutting edge diameter: 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cutter&#160;</td>
			<td>Syneo</td>
			<td>HS1871730P1183S</td>
			<td>Cutting edge diameter: 4.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilometer&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Dektak XT-stylus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>H&#228;berle Labortechnik</td>
			<td>9156110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerator</td>
			<td>Haden</td>
			<td></td>
			<td>4-6 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga R1 CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch magic tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>3969954</td>
			<td>19 mm invisible tape; clear tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10257954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass plate</td>
			<td>Inseto</td>
			<td></td>
			<td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spincoater&#160;</td>
			<td>SAWATEC</td>
			<td>SM-180-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634165S</td>
			<td>Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td>Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner S-Line</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>FB15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10528861</td>
			<td>Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH20105</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td>Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic tools for probing fungal-microbial interactions at the cellular level

Filamentösa svampar är framgångsrika invånare i jorden och spelar en viktig roll i markens ekosystem, såsom vid nedbrytning av organiskt och oorganiskt material, samt reglering av näringsnivåer. Där hittar de också många möjligheter att interagera med en mängd andra mikrober som bakterier eller andra svampar. Att studera svampinteraktioner på cellnivå kan dock vara utmanande på grund av jordens svarta lådliknande natur. Nya mikrofluidiska verktyg utvecklas för studier av svampinteraktioner; två plattformar som är utformade för att studera bakteriell-svamp och svamp-svampinteraktioner lyfts fram. Inom dessa mikrokanaler kan svamp-mikrobiella interaktioner övervakas i kontrollerade fysikalisk-kemiska miljöer med högre tidsmässig och rumslig upplösning än vad som tidigare varit möjligt. Tillämpningen av dessa verktyg har gett många nya biologiska insikter, såsom observation av bakteriell polär bindning till hyfer eller avslöjande av okarakteriserade svamp-svamp-antagonismer. Ett viktigt inslag i dessa metoder är att det är lätt att använda detta verktyg av icke-experter, vilket ger mycket översättningsbar teknik för användning i mikrobiologilaboratorier.

Representativa resultat presenteras från exemplen BFI40 och FFI41-enheter. Hyphal-tillväxthastighetsmätningar kan enkelt erhållas med hjälp av dessa enheter i kombination med grundläggande mikroskopitekniker. Figur 3A-B illustrerar bakterie-svampinteraktioner mellan C. cinerea hyphae och B. subtilis NCIB 3610. Närvaron av B. subtilis stoppar tillväxten av C. cinerea e...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level at JoVE.com

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

På grund av jordens opacitet kan interaktioner mellan dess ingående mikrober inte lätt visualiseras med cellulär upplösning. Här presenteras två mikrofluidiska verktyg som erbjuder nya möjligheter att undersöka svamp-mikrobiella interaktioner. Enheterna är mångsidiga och enkla att använda, vilket möjliggör hög spatiotemporal kontroll och högupplöst avbildning på cellnivå.

Mikrofluidiska verktyg för att undersöka svamp-mikrobiella interaktioner på cellnivå

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Med hjälp av de presenterade mikrofluidiska enheterna kan vi undersöka dynamiska interaktioner mellan svampar och andra mikrober med exakt spacial och miljökontroll, samt högupplöst avbildning på encellsnivå. Viktigt är att svamptillväxt kan begränsas och riktas inom den mikrofluidiska kanalen. Gör det möjligt att få högkvalitativa time lapse-bilder.Därför kan komplexiteten i svamp-svamp- och svamp-bakterieinteraktioner undersökas. Att förstå svampmikrobiella interaktioner är ett viktigt steg för att definiera och bevara jordmikrobiomet. Denna kunskap kan utnyttjas för utveckling av nya biologiska bekämpningsmedel med hållbart jordbruk.För att börja, förbered cirka 40 gram poly (dimetylsiloxan) eller PMM, genom att noggrant blanda basen och härdningsmedlet i ett förhållande 10 till 1 med en spatel i en ren plastkopp. För att ta bort alla luftbubblor, placera koppen i en vakuumkammare i en timme. Därefter, med klar tejp, säkra huvudformen i ett plastfäste och använd komprimerad filtrerad luft för att ta bort eventuella dammpartiklar, häll sedan PMM: erna på mitten av huvudformen och låt den sätta sig.För att förhindra sedimentering av dammpartiklar på PPM-ytan, täck försiktigt huvudformen med ett plastlock, överför sedan huvudformen till en ugn och härda över natten vid 70 grader Celsius. När du har tagit bort huvudformen från ugnen och låtit den svalna, dra bort de härdade PTM: erna från huvudformen och plastramen utan att skada huvudformen i PMM: erna. För att bibehålla en dammfri yta, placera sedan klar tejp över mikrokanalerna präglade i PPM: erna.Använd sedan en monterad giljotin eller ett rakblad för att skära PDM: erna i plattor som anges av designen. När du skär sidoöppningen på PPM-plattan som används för bakterie-svampinteraktionsanordningen, eller BFI-enheten, se till att mikrokanalerna är helt öppna. Men för PPM-plattor som används vid montering av svamp-svampinteraktionsanordningen, eller FFI, bör varje hörn trimmas så att det passar in i en petriskål med glasbotten.Använd sedan en precisionsskärare för att stansa inlopps- eller utloppshål enligt enhetens design. Sänk sedan PPM-plattorna i en 0,5 molär natriumhydroxidlösning. Skölj plattorna i sterilt dubbeldestillerat vatten innan du överför dem till en 70% etanollösning.Efter att ha tagit bort etanolen och sköljt plattorna med dubbeldestillerat sterilt vatten igen, sänk ner plattorna i sterilt dubbeldestillerat vatten och ultraljudikat i fem minuter, ta sedan bort PPM-plattan från vattnet, torka dem med komprimerad filtrerad luft och placera dem i en steril fyrkantig petriskål. Inkubera sedan petriskålen med PPM-platta i en ugn vid 70 grader Celsius i en timme. När plattorna har svalnat i en dammfri miljö, rensa bort damm från ytan med tejp och komprimerad filtrerad luft.För att aktivera ytorna på PPM-plattorna och petriskålarna med glasbotten, som sedan kommer att bindas ihop, placera dem i en plasmarengörare med ytorna som ska aktiveras uppåt. När du har tagit bort PDM-plattan i petriskålarna från plasmarengöraren, bind dem försiktigt genom att placera de aktiverade ytorna i konform kontakt med varandra. Bond BFI och FFI PDMs-platta med petriskålar på 35 millimeter respektive 55 millimeter diameter för att kontrollera den framgångsrika bindningen, försök att dra PDMs-labbet från sin petriskål med pincett.Visualisera enheten noggrant med ögat eller genom generisk mikroskopi för att säkerställa att inokuleringsinloppen eller mikrokanalerna inte kollapsar. För vattenmättade eller näringsrika förhållanden, pipettera 100 mikroliter av den önskade lösningen för att fylla BFI-enheter omedelbart efter bindning. För FFI-enheter, lägg till 30 mikroliter av media i varje inlopp.Slutligen tillsätt 100 till 200 mikroliter sterilt dubbeldestillerat vatten till petriskålen för att bibehålla fuktigheten. Men för vattenomättade förhållanden, tillsätt bara 100 till 200 mikroliter sterilt dubbeldestillerat vatten till petriskålen för att bibehålla fuktigheten. För svampinokulering, inuti en laminär flödeshuv, med en steriliserad korkborrare, ta bort en agarplugg från en koloni i periferin av en tre dagars gammal kultur, så att den växande hyphalffronten hålls intakt.För sedan in agarpluggen i svampinloppet till BFI- och / eller FFI-enheten med mycelsidan nedåt i hyphalfronten orienterad mot mikrokanalöppningarna för att uppmuntra hyphalinfiltration av kanalerna. För FFI-enheten, introducera en annan agarplugg med en andra svampart i motsatt inlopp. Försegla sedan petriskålen med en transparent film och inkubera vid 25 till 28 grader Celsius i mörkret tills avbildning.För bakteriell ympning, efter avlägsnande av BFI-anordningen från inkubatorn, pipetterar 10 mikroliter av en bakteriesuspension i bakterieinloppet i en steril miljö. När petriskålen är förseglad med en transparent film, förvara enheten upprätt vid 25 grader Celsius i mörkret tills avbildning börjar. Med hjälp av detta protokoll kunde interaktionen mellan svampen Coprinopsis cinerea och bakterien Bacillus subtilis framgångsrikt visualiseras.Det observerades att i närvaro av bakterien började svampens tillväxthastighet minska drastiskt efter cirka fem timmars myntokulering. Dessutom hade svamphyferna associerade med bakterierna ett tunt och transparent utseende. Tidsfördröjning fluorescensmikroskopi avslöjade också svamphyferkollaps efter fem timmars samkokning med Bacillus subtilis.Men från sex timmar och framåt började bakteriepopulationen också minska. Visualisering av svamp-svampinteraktioner visade att Fusarium graminearum starkt hämmade tillväxten av Trichoderma rossicum, vilket var uppenbart med hjälp av fluorescensmikroskopi. Detta protokoll avslöjade vidare signifikanta morfologiska förändringar i svampen Verticillium longisporum i närvaro av bakterier Pseudomonas synxantha och Pseudomonas fluorescens.Den högupplösta dynamiska avbildningstekniken som användes i studien avslöjade också septabildning i Fusarium graminearum i närvaro av svampen Clonostachys rosea. Fluorescensmärkning gav den dynamiska kvantifieringen av Clonostachys rosea hyphal-spridning i FFI-enheten. Dessa enheter kan anpassas och modifieras av användaren för att införliva olika arter av intresse och ta itu med deras specifika experimentella frågor om svampmikrobiella interaktioner.Både BFI- och FFI-enheterna har drivit vetenskapliga gränser och avslöjat hur svampar sprider försvarssignaler och näringsämnen vid angrepp av svampar, virus, nematoder och möjliggör undersökningar av bakteriell spridning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

En mikroflödessystem-baserad Hydrodynamisk fälla för enstaka partiklar

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Vidhäftning Frekvens analys för In Situ Kinetik Analys av Cross-Junktional Molekylär växelverkan vid cell-cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastställande av transport Andel Xenobiotika och nanomaterial igenom moderkakan med<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusionen Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ och Temporal Kontroll av syremikromiljö vid den inre Islet nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikroflödessystem med Surface Mönstring för utredning Kavitation Bubble (s) -cell Interaktion och den resulterande bioeffekter vid encelliga nivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...