Fremstilling af konstruerede vaskulære klapper ved hjælp af 3D-printteknologier

Vores protokol giver forskere mulighed for at generere hierarkiske fartøjsnetværk inden for en fuldt konstrueret og implanterbar klap, hvilket banede vejen for nye undersøgelser af blodkaradfærd under integration in vivo. Denne teknik kombinerede alsidigheden af to 3D-printteknologier til at skabe og samle skibe på mikro- og mesoskalaen, der kan anastomoseres direkte med værtsfartøjer ved hjælp af mikrokirurgi. Fuldt konstruerede vaskulariserede klapper kan bruges til at behandle store vævsdefekter samt til at give en platform til undersøgelse af vævsudvikling og integration.

De foreslåede metoder kan udvides til at studere inkorporering af vævsspecifikke celler samt til at evaluere brugen af forskellige bioink- og støttematerialer. Begynd med at udfylde BVOH-formen med 30 mikroliter af polymeropløsningen. Formen centrifugeres 100 gange g i 2 minutter, og formen fyldes op med yderligere 20 mikroliter af polymeropløsningen for at sikre fuldstændig påfyldning.

De fyldte forme fryses ved minus 80 grader Celsius i mindst 30 minutter for at sikre, at hele polymeropløsningen fryser. Fjern opløsningsmidlet fra formene ved at fryse dem natten over. For at fjerne offerformmaterialet overføres formene efter frysetørringsprocessen til et 5-liters deioniseret vandbad under skånsom omrøring.

Udskift vandet i badet, når det bliver overskyet. Når al BVOH opløses, lufttørres stilladserne og opbevares i et vakuumkammer indtil brug. Overfør ca. 4 ml af det forberedte, komprimerede støttemateriale til hver brønd i en 12-brønds plade ved hjælp af en positiv forskydningspipette.

Tryk på brøndpladen på en hård overflade for at tvinge støttematerialet til at sprede sig jævnt i brønden. Forbered en suspension indeholdende 2 millioner HAMEC-ZsGreen og 6 millioner tandmasse stamceller i 10 ml endotelcellemedium. Centrifugeres cellesuspensionen ved 200 gange g i 4 minutter for at opnå en cellepellet, derefter aspireres supernatantmediet og resuspender cellepillen i 1 milliliter rhCollMA bioink for at opnå en bioink med en samlet cellekoncentration på 8 millioner celler pr. 1 milliliter bioink.

Monter en 0,22 millimeter kanyle med indvendig diameter på en 3 ml gul udskrivningspatron, og anbring patronen i et 50 ml konisk rør. Overfør 1 milliliter af celle-bioink-blandingen til udskrivningspatronen ved at fylde den fra toppen ved hjælp af en positiv forskydningspipette for at reducere bobler. Installer udskrivningspatronen i det relevante værktøj på bioprinteren.

Skitse et 2D-mønster af en 4 millimeter firkant indeholdende en cirkulær kanal med en diameter på 2 millimeter i midten. Ekstruder skitsen med 4 millimeter for at opnå en 4 millimeter terning med en central kanal. Eksporter dette objekt som en STL-fil.

Importer en 12-brønds plade STL-skabelon til den solide modelleringsfane i bioprintersnitssoftware, og placer den i det udpegede område af den virtuelle printseng. Importer STL-filen for terningformen til den dækkende modelleringsfane i bioprinterudskæringssoftwaren. Klik på afkrydsningsfeltet Brug ekstern slicer efterfulgt af konfigurer slicer under objektegenskabsafsnittet.

I pop op-vinduet skal du vælge et retlinet mønster til fyldmønsteret og skrive 30% i fyldtætheden, klikke på accept. Klik på terningen og flyt den ved hjælp af musen for at placere en kopi af terningformen i hver ønsket virtuel brønd. Klik på knappen Tilføj materiale i fanen Materialer i bioprintersnitssoftware for at oprette nye materialeindstillinger til rhCollMA bioink.

Vælg materialeindstillingerne til udskrivning. For tryk, type 2 psi, og for hastighed type 20 millimeter per sekund i de tilsvarende kasser. Tildel værdierne for linjebredde og linjehøjde til 0,24 millimeter og accelerationsværdien til 400 millimeter pr. kvadratsekund.

I den solide modelleringsfane skal du klikke på terningobjektet og derefter klikke på rhCollMA-materialet fra materialeafsnittet for at tildele det til terningformen. På fanen bioenhed skal du klikke på knappen Send udskriftsjob for at sende udskriftsjobbet til bioprinteren. Læg udskrivningspatronen, der er fyldt med den cellulære bioink, i det 3 ml omgivende pneumatiske dispenseringsværktøj på den 3D-ekstruderingsbaserede bioprinter.

Klik på knappen Cool under fanen Kontrolopvarmning eller køling på bioprinterinterfaceskærmen for at indstille printlejetemperaturen til 4 grader Celsius. Læg pladen med støttebadet på printerlejet. På fanen Udskriv på bioprinterinterfaceskærmen skal du klikke på udskriftsjobbet og derefter klikke på Start efterfulgt af GO for at starte udskriftsjobbet.

Efter udskrivning udsættes brøndpladen for en 405 nanometer lyskilde med en intensitet på 3 milliwatt pr. Kvadratcentimeter i 30 sekunder for at starte tværbindingen af rhCollMA-bioink. Efter tværbinding inkuberes brøndpladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i mindst 20 minutter, indtil alt støttebadet smelter. Opsuge forsigtigt det flydende støttebad og udskift det med endotelcellemediet.

Inkuber konstruktionerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Umiddelbart efter fjernelse af støttemateriale af det bioprintede mikrovaskulære netværk anbringes et fibronektinbelagt PLLA: PLGA vaskulært stillads ved siden af den bioprintede struktur. Indsæt vaskulærstilladset i hovedkanalen i den bioprintede struktur.

Inkuber de samlede konstruktioner ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i to dage. Forbered en cellesuspension af tdTomato-ekspressive humane fedtmikrovaskulære endotelceller i en koncentration på 10 millioner celler pr. Milliliter. Placer en 20-mikroliter dråbe af denne celle suspension på en hydrofob overflade.

Placer forsigtigt de vaskulære stilladser oven på dråben, så stilladsets lumen i den ene ende kommer i kontakt med celledråben. Aspirer dråben fra den modsatte ende af stilladset, der fylder dens lumen med celleophænget. Placer det siddende stillads i et mikrocentrifugerør og læg det i en rotator inde i en befugtet inkubator i 60 minutter.

Til sidst overføres stilladset til en 12-brøndplade og tilsættes 2 ml endotelcellemedium. Sidebilledet af en repræsentativ konstrueret klap afbildet fire dage efter endotelforingen af vaskulærstilladset er vist her. Den bioprintede mikrovaskulatur er vist med grønt, mens endotelforingen er vist med rødt.

Det repræsentative billede viser anastomoserne mellem den bioprintede vaskulatur og endotelforingen. Immunostaining for glat muskel actin, kerner og endotelceller efter syv dages inkubation er vist her. Det repræsentative billede viser færdige anastomoser af den konstruerede klap med en rottes lårbensarterie før klemmefjernelsen og efter klemmefjernelsen.

Denne teknik kan bruges til at studere modning og integration af 3D-printet vaskulatur in vivo og overvåge perfusionen af implantatet i bagbenet for at fastslå potentialet og sikkerheden for dets anvendelse til behandling af vævsdefekter.