우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 완전히 설계되고 이식 가능한 플랩 내에서 계층 적 혈관 네트워크를 생성 할 수 있으며, 이는 생체 내에서 통합되는 혈관 행동에 대한 새로운 연구를위한 길을 열었습니다. 이 기술은 두 가지 3D 프린팅 기술의 다양성을 결합하여 미세 수술을 사용하여 호스트 혈관으로 직접 해부학 적으로 분석 할 수있는 마이크로 및 메조 스케일의 용기를 만들고 조립합니다. 완전히 조작된 혈관화된 플랩은 큰 조직 결함을 치료하고 조직 개발 및 통합을 연구하기 위한 플랫폼을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
제안 된 방법은 조직 특이적 세포의 혼입을 연구 할뿐만 아니라 다른 바이오 잉크 및 지지체 물질의 사용을 평가하기 위해 확장 될 수 있습니다. BVOH 주형을 30 마이크로리터의 중합체 용액으로 채우는 것으로 시작한다. 주형을 2분 동안 100배 g에서 원심분리하고, 완전한 충전을 보장하기 위해 추가로 20 마이크로리터의 중합체 용액으로 주형을 충전한다.
채워진 금형을 영하 80도에서 적어도 30 분 동안 동결시켜 모든 폴리머 용액이 동결되도록하십시오. 밤새 동결건조하여 주형으로부터 용매를 제거한다. 희생 몰드 재료를 제거하려면 동결 건조 공정 후 몰드를 부드러운 교반 하에 5리터 탈이온수 욕조로 옮깁니다.
흐려지면 욕조의 물을 교체하십시오. 모든 BVOH가 용해되면, 스캐폴드를 공기 건조시키고 사용 전까지 진공 챔버에 보관한다. 준비된 압축 된 지지 재료의 약 4 밀리리터를 포지티브 변위 피펫을 사용하여 12 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
딱딱한 표면의 웰 플레이트를 탭하여 지지 재료가 웰에 고르게 퍼지도록 강제합니다. 2백만 HAMEC-ZsGreen과 6백만 개의 치과용 펄프 줄기세포를 10밀리리터의 내피세포 배지에 담은 현탁액을 준비한다. 세포 현탁액을 200배 g에서 4분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수득한 다음, 상층액 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 1 밀리리터의 rhCollMA 바이오잉크에 재현탁시켜 바이오잉크 1 밀리리터당 총 세포 농도 8백만 세포의 바이오잉크를 얻었다.
0.22mm 내부 직경 바늘을 3밀리리터 호박색 인쇄 카트리지에 맞추고 카트리지를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 1 밀리리터의 세포-바이오잉크 혼합물을 포지티브 변위 피펫을 사용하여 위에서 채워서 인쇄 카트리지로 옮겨 기포를 줄입니다. 인쇄 카트리지를 바이오 프린터의 해당 도구에 설치합니다.
중앙에 직경 2mm 원형 채널이 포함된 4mm 정사각형의 2D 패턴을 스케치합니다. 스케치를 4mm 밀어서 중앙 채널이 있는 4mm 큐브를 가져옵니다. 이 개체를 STL 파일로 내보냅니다.
12웰 플레이트 STL 템플릿을 바이오프린터 슬라이싱 소프트웨어의 솔리드 모델링 탭으로 가져와 가상 프린트 베드의 지정된 영역에 배치합니다. 큐브 모양의 STL 파일을 바이오 프린터 슬라이싱 소프트웨어의 솔리드 모델링 탭으로 가져옵니다. 외부 슬라이서 사용 확인란을 클릭한 다음 개체 속성 섹션 아래에서 슬라이서 구성을 클릭합니다.
팝업 창에서 채우기 패턴의 직선형 패턴을 선택하고 채우기 밀도에 30%를 입력하고 수락을 클릭합니다. 큐브를 클릭하고 마우스를 사용하여 큐브 모양의 복사본을 원하는 각 가상 웰에 배치합니다. 바이오 프린터 슬라이싱 소프트웨어의 재료 탭에서 재료 추가 버튼을 클릭하여 rhCollMA 바이오 잉크에 대한 새로운 재료 설정을 만듭니다.
인쇄할 재료 설정을 선택합니다. 압력의 경우 2 psi를 입력하고 속도의 경우 해당 상자에 초당 20 밀리미터를 입력하십시오. 선 너비 및 선 높이 값을 0.24mm로, 가속도 값을 평방 초당 400mm로 할당합니다.
솔리드 모델링 탭에서 큐브 객체를 클릭한 다음 재료 섹션에서 rhCollMA 재질을 클릭하여 큐브 모양에 할당합니다. bioassembly 탭에서 인쇄 작업 보내기 단추를 클릭하여 인쇄 작업을 바이오 프린터로 보냅니다. 셀룰러 바이오잉크가 로딩된 인쇄 카트리지를 3D 압출 기반 바이오프린터의 3밀리리터 주변 공압 분배 도구에 로드합니다.
바이오 프린터 인터페이스 화면의 가열 또는 냉각 제어 탭 아래의 냉각 버튼을 클릭하여 인쇄층 온도를 섭씨 4도까지 설정하십시오. 프린터 침대에 지지대와 함께 플레이트를 로드합니다. 바이오 프린터 인터페이스 화면의 인쇄 탭에서 인쇄 작업을 클릭 한 다음 시작을 클릭 한 다음 GO를 클릭하여 인쇄 작업을 시작하십시오.
인쇄 후, 웰 플레이트를 평방 센티미터당 3밀리와트의 강도로 305나노미터 광원에 30초 동안 노출시켜 rhCollMA 바이오잉크의 가교결합을 개시한다. 가교결합 후, 웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 모든 지지체 욕조가 녹을 때까지 적어도 20분 동안 인큐베이션한다. 액화된 지지체 배쓰를 부드럽게 흡인하고 내피 세포 배지로 교체한다.
섭씨 37도에서 구조물을 인큐베이션하고 5 % 이산화탄소를 배양하십시오. 생체 인쇄 된 미세 혈관 네트워크의 지지체 물질 제거 직후, 피브로넥틴 코팅 PLLA:PLGA 혈관 스캐폴드를 생체 인쇄 구조 옆에 놓습니다. 혈관 스캐폴드를 생체 인쇄 구조의 주 채널에 삽입하십시오.
조립 된 구조물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5 %에서 이틀 동안 배양하십시오. tdTomato 발현 인간 지방 미세혈관 내피 세포의 세포 현탁액을 밀리리터당 1천만 세포의 농도로 제조한다. 이 세포 현탁액의 20 마이크로 리터 액적을 소수성 표면에 놓습니다.
혈관 스캐폴드를 액적 위에 부드럽게 올려 놓으면 한쪽 끝에있는 스캐폴드의 내강이 세포 액적과 접촉합니다. 스캐폴드의 반대쪽 끝에서 물방울을 흡인하여 세포 현탁액으로 루멘을 채 웁니다. 앉은 스캐폴드를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 60분 동안 가습 인큐베이터 내부의 회전기에 넣습니다.
마지막으로, 스캐폴드를 12-웰 플레이트로 옮기고 2 밀리리터의 내피 세포 배지를 첨가한다. 혈관 스캐폴드의 내피 라이닝 후 나흘 후에 이미지화된 대표적인 조작된 플랩의 측면도가 여기에 도시되어 있다. 생체 인쇄 된 미세 혈관은 녹색으로 표시되고 내피 내막은 빨간색으로 표시됩니다.
대표적인 이미지는 생체 인쇄 된 혈관 구조와 내피 내막 사이의 해부학을 보여줍니다. 칠일 배양 후 평활근 액틴, 핵 및 내피 세포에 대한 면역염색이 여기에 제시되어 있다. 대표적인 이미지는 클램프 제거 전과 클램프 제거 후 쥐의 대퇴 동맥을 가진 엔지니어링 플랩의 완성 된 해부학을 보여줍니다.
이 기술은 생체 내에서 3D 인쇄 혈관 구조의 성숙 및 통합을 연구하고 뒷다리에 임플란트의 관류를 모니터링하여 조직 결함을 치료하는 데 사용할 가능성과 안전성을 확립하는 데 사용할 수 있습니다.
