Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

نحن نعترف بمصدر ضوء الماس للوصول إلى مرافق cryo-EM ودعمها في المركز الوطني للتصوير الحيوي الإلكتروني في المملكة المتحدة (eBIC) ، بتمويل من Wellcome Trust و MRC و BBRSC. نود أيضا أن نشكر أندرو هاو على اقتناء التصوير المقطعي Apoferritin (الفيلم 1) ، و Ishika Kumar لإعداد واقتناء التصوير المقطعي للخلايا العصبية (الفيلم 2) ، و Craig MacGregor-Chatwin ل Cyanobacteria lamella-tomogram (الفيلم 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

تومو5 يسلط وصف سير العمل لبرنامج التصوير المقطعي الضوء على إحدى الطرق المحتملة والأكثر انسيابية لإعداد جلسة التصوير المقطعي الدفعي (عن بعد). على الرغم من أن البرنامج سهل للمبتدئين ، إلا أن بعض تجارب cryo-EM الأولية وفهم التصوير المقطعي الأساسي يمكن أن يساعد في الإعداد. يتم تمييز الخطوات الهامة في البروتوكول ويجب أن تساعد في استكشاف الأخطاء وإصلاحها حتى في حالة استخدام نهج إعداد مختلف. سيؤدي تقدم البرنامج إلى تسهيل جمع البيانات (عن بعد) وجعل cryo-ET أكثر سهولة لقاعدة واسعة من المستخدمين. فيما يلي بعض النصائح والحيل التي يمكن أن تساعد في استكشاف المشكلات التي تتم مواجهتها بشكل شائع وإصلاحها.
إحدى النقاط المهمة التي يجب مناقشتها هي اختيار الشبكات لأنه عند إمالة العينة إلى ±60 درجة ، يمكن لقضبان الشبكة عند الإمالات العالية أن تحجب الرؤية (الشكل 8). على شبكة TEM ، يشير حجم الشبكة إلى عدد مربعات الشبكة لكل وحدة طول الشبكة. تحتوي أرقام الشبكات الأكبر على مربعات شبكة أكبر لكل طول وحدة ، وكثافة أعلى من مربعات الشبكة ، ومربعات شبكة أصغر ، أي أن الشبكة المكونة من 400 شبكة تحتوي على مربعات أصغر من شبكة 200. اختيار جيد للشبكات للتصوير المقطعي هو شبكة 200 أو 300 شبكة. كما هو موضح في الشكل 8 ، يتم تقليل المساحة المتاحة للجمع مع إمالة الشبكة. عند إمالة ±60 درجة ، سيكون لشبكة 300 شبكة مجال رؤية صغير يمكن من خلاله الحصول على تصوير طيني كامل. تتمثل مزايا الشبكات المكونة من 200 شبكة في أن مربعات الشبكة الأكبر تجعل إعداد التصوير المقطعي الجزيئي أسرع ، ومع زيادة مساحة مربع الشبكة ، من المرجح أن يكون مربع واحد كافيا لجمع بين عشية وضحاها. العيب هو أن الشبكات ذات 200 شبكة أكثر هشاشة ، لذا فإن المناولة والقطع يتطلبان المزيد من الدقة.
علاوة على ذلك ، في حالة استخدام فيلم دعم holey (انظر جدول المواد) على شبكات EM ، يجب مراعاة تباعد الثقوب لإعداد منطقة التركيز والتتبع فيما يتعلق بمنطقة التعرض. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون قطر الشعاع عند التكبير المطلوب صغيرا بما يكفي لتغطية منطقة الكربون المجاورة لمنطقة التعرض على طول محور الإمالة للإعداد الأمثل والسريع. بهذه الطريقة ، يمكن الحصول على المناطق المحتملة ذات الأهمية في كل حفرة.
نظرا لأن روتين الارتفاع المتمركز حول eucentric الخاص بالبرنامج ليس قويا حاليا ، مثل روتين serialEM ، يمكن أن تعمل النصائح التالية على حل هذه المشكلة. إذا فشل تحديد الارتفاع eucentric باستخدام الإعداد المسبق للارتفاع eucentric ، فيمكن للمرء استخدام الإعداد المسبق للنظرة العامة بدلا من ذلك وإعادة تشغيل "Auto-eucentric by stage tilt" ؛ هذا يمكن أن يحل المشكلات إذا كان ارتفاع eucentric بعيدا عن 0. إذا نجح ذلك ، فيمكن للمرء إعادة تشغيل "Auto-eucentric by stage tilt" مع الإعدادات المسبقة "Eucentric Height" لتحسين الدقة. إذا فشلت ، يمكن للمرء تشغيل "Auto-Eucentric by beam tilt" مع الإعداد المسبق لارتفاع eucentric ثم إعادة تشغيل "Auto-Eucentric by stage tilt" أو تعيين ارتفاع z يدويا المدمجين بواسطة "Auto-Eucentric by beam tilt" في واجهة مستخدم TEM ضمن إعدادات "المرحلة". في حالة استخدام شبكات ذات نمط متكرر من الثقوب ، فقد تمنع تحديد ذروة ارتباط متقاطعة واحدة. يمكن للمرء أن يحاول تغيير الإعداد المسبق للارتفاع eucentric إلى إزاحة أقل لإلغاء التركيز البؤري مثل -25 ميكرومتر و / أو وقت تعرض أقصر لتقليل الارتباط المتبادل من أنماط الثقوب. من ناحية أخرى ، قد لا يوفر استخدام شبكات / صفيحة الدانتيل إشارة كافية لذروة ارتباط متقاطعة قوية. يمكن للمرء أن يحاول تغيير الإعداد المسبق للارتفاع المركزي إلى إزاحة أكبر لإلغاء التركيز البؤري مثل -75 ميكرومتر و / أو وقت التعرض الممتد لتعزيز ذروة الارتباط المتقاطع. خيار آخر هو ضبط إعدادات مرشح الصورة. يمكن العثور عليها في علامة التبويب "التحضير". يمكن تعيين خيارات ضبط إعدادات المرشح للانخفاض (نظرة عامة/Gridsquare)، والمتوسط (الارتفاع Eucentric)، والتكبير العالي (التتبع/التركيز البؤري) للعثور على ذروة الارتباط المتبادل المثلى لكل إعداد مسبق. الإدخال المطلوب هو صورة واحدة ، أي عند 0 درجة وواحدة عند 5 درجات ، متبوعة بالنقر فوق مقارنة لمقارنة كلتا الصورتين. قيمة البدء الموصى بها لأطول طول موجي هي ربع شريط المقياس في الصورة ولأقصر طول موجي هو واحد من أربعين من شريط المقياس. إذا لم يتم تحديد الذروة بقوة ، فيمكن للمرء تحسين الإعدادات حتى يمكن العثور على ذروة مقنعة. ليست هناك حاجة لإعادة الحصول على الصور في كل مرة. ببساطة الضغط على "مقارنة" يكفي. إذا كان TOMO لا يزال يفشل في العثور تلقائيا على الارتفاع eucentric ، فيمكن استخدام معايرة الارتفاع اليدوي eucentric. يجب على المرء أن يتمركز فوق بلورة ثلج كبيرة بشكل معقول في تكبير النظرة العامة في علامة التبويب "التحضير" ، ثم انتقل إلى "التحكم في المرحلة" لواجهة مستخدم TEM ، واضبط ألفا على -30 درجة ، واضبط قيمة المرحلة z لإعادة توسيط البلورة باستخدام صورة شاشة الفلورسنت. إن تحديد إعدادات "الدقة العالية" و "التباين العالي" في واجهة مستخدم TEM سيجعل هذا الأمر بسيطا (أزرار في أسفل نافذة شاشة الفلورسنت). اختياريا ، إذا كان هناك وصول إلى كاميرا ذات وضع مباشر ، فيمكن استخدام ذلك لتحديد الارتفاع المركزي ؛ سيكون أسهل من شاشة الفلورسنت.
أكبر القيود في إصدارات Tomo5 قبل 5.8 هي مونتاج التكبير المتوسط المفقود ، والمخطط المتماثل للجرعة المفقودة ، والمشاكل المتعلقة بالعثور على ارتفاع eucentric. هذه موجودة في serialEM ، وهي برامج مجانية مع التطوير السريع ودعم المجتمع ، وروتين ارتفاع قوي eucentric ، وخيار الكتابة ، أي مخطط متماثل للجرعة مصمم خصيصا. من الإصدار 5.8 فصاعدا في Tomo5 ، تم حل المشكلة الأكثر شيوعا للعثور على الارتفاع eucentric ، أي حلقة غير ناجحة حول قيمة z المستهدفة ، من خلال تنفيذ خيار تعيين معيار قبول الارتفاع eucentric. ومع ذلك ، مع اختلاف أنواع الشبكات والعينات ، يوصى بشدة بضبط إعدادات مرشح الصورة لتعكس ظروف التصوير الفريدة للجلسات الفردية ولإعطاء أفضل ذروة ارتباط متقاطعة ممكنة للعثور على الارتفاع eucentric ولكي تعمل منطقة التركيز والتتبع بشكل موثوق أثناء الحصول على التصوير المقطعي.

وبشكل عام، تكيفت العديد من المرافق بسرعة مع التشغيل عن بعد خلال الوباء. يوفر برنامج Tomo5 وصولا سهلا وطريقا سهل الاستخدام إلى التصوير المقطعي وهو مناسب تماما للتشغيل عن بعد. ومما لا شك فيه أن التقدم المحرز في البرنامج سيستمر في جعل جمع البيانات عن بعد وجمع التصوير المقطعي بشكل عام أكثر شيوعا في المجتمع.
إمالوضوح نظرا لأن emClarity يستخدم طريقة اختيار الجسيمات المستندة إلى القالب ، فإنه يحتاج إلى قالب للكائن محل الاهتمام. اختيار الجسيمات (الخطوة 2.6) حساس للغاية ومفتاح البنية النهائية. قبل المتوسط والمحاذاة (الخطوة 2.9) ، يجب على المرء التأكد من التحقق بعناية وإزالة الإيجابيات الخاطئة يدويا. عندما لا يكون القالب متاحا، قد لا يكون emClarity سهل الاستخدام، ولكن من الممكن استخدام برامج أخرى، على سبيل المثال، Dynamo37 وPEET48، لإنشاء نموذج أولي.
بالنسبة للعينات غير المتجانسة ، تم تجهيز emClarity بطريقة تصنيف تمكن المستخدمين من التركيز على ميزات محددة بمقاييس مختلفة. من المفيد تشغيل بضع دورات من المحاذاة قبل التصنيف وتشغيلها في حاوية أعلى (مثل bin 4 أو bin 3).
يحتوي الإصدار المحدث من البرنامج (V1.5.3.11) على تحديثات مهمة مقارنة بالإصدار الأول (V1.0)17. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، فحص اليد أثناء تقدير CTF (الخطوة 2.3) ؛ تناظر المحاذاة (CX ، I ، I2 ، O) ؛ حساب وظائف أخذ العينات ثلاثية الأبعاد لكل جسيم (3DSF) ؛ التبديل إلى MATLAB 2019a للتوافق والاستقرار ؛ وإعادة الإعمار باستخدام صور الإسقاط الخام (cisTEM). سيستمر البرنامج في التحسن لعينات مختلفة ، ويمكن العثور على أحدث الإعلانات عبر الإنترنت (انظر جدول المواد).

من المعروف على نطاق واسع أن المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) قد شهد فترة نهضة ، مما أدى إلى تسريعه ليصبح أداة أساسية ومفيدة مركزيا في البيولوجيا الهيكلية. تطوير واستخدام كاشفات الإلكترونات المباشرة1،2،3 ، وتحسين المجاهر ومصادر الإلكترون3،4،5 ، والتحسينات في الأتمتة / الإنتاجية6،7،8،9 ، والتقدم الحسابي في تحليل الجسيمات المفردة 10،11،12،13 ، 14 والتصوير المقطعي15،16،17 كلها ، جزئيا ، مسؤولة عن النجاح الأخير لهذه التقنية. وقد طورت هذه الدوافع التكنولوجية قدرة cryo-EM على حل الهياكل الجزيئية البيولوجية الكبيرة في ظل الظروف المبردة والأصلية. إن القرارات التي يمكن الحصول عليها بسهولة كافية للنمذجة الدقيقة ذريا وقد جلبت هذه التقنية إلى طليعة ساحة البيولوجيا الهيكلية. لطالما أثبت النهج الاختزالي للتعبير عن هدف بيولوجي ذي أهمية وتنقيته نجاحه في علم البلورات الجزيئية الكبيرة (MX) للبحوث البيولوجية الأساسية واكتشاف الأدوية والعلوم الانتقالية. في نفس النهج ، يمكن ل cryo-EM الآن تقديم نتائج موازية لدراسات MX عالية الدقة. يسمى النجاح الكبير الحالي في فرع cryo-EM من البيولوجيا الهيكلية تحليل الجسيمات المفردة (SPA) ، والذي يكتسب صور إسقاط ثنائية الأبعاد عادة لعينة بروتين منقية18 للحصول على آلاف المشاهدات لجزيء بيولوجيكبير 19. تحتوي هذه الصور (1) على معلومات من مجموعة من وجهات النظر التي تمثل بشكل كامل اتجاهات الهدف في الفضاء ثلاثي الأبعاد و (2) تلتقط عدم التجانس التوافقي للجسم ، والذي يمكن فصله والتحقيق فيه لاحقا.
وهناك نهج بديل للحصول على صور الإسقاط 2D هذه للعينات البيولوجية ، حتى في الموقع وبدون تنقية ، هو التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني (cryo-ET). يلتقط Cryo-ET سلسلة من الصور لنفس الجسم بزوايا مائلة عن طريق تدوير العينة ميكانيكيا. وبالتالي ، فإن الإسقاطات ثنائية الأبعاد التي تم جمعها في SPA ، والتي تمثل الوضعيات الزاوية للجزيء محل الاهتمام ، يتم جمعها بطبيعتها كجزء من تجربة التصوير cryo-ET20. ثم يتم إعادة بناء سلسلة الإمالة المقطعية في تصوير مقطعي يحتوي على تمثيلات 3D للمجمعات الجزيئية الكبيرة المصورة. طبيعة جمع البيانات المقطعية ، إلى حد ما ، تقلل من الاعتماد على المتوسط لتحقيق تمثيل كامل 3D لجزيء من مجموعة من الصور 2D. ومع ذلك ، نظرا لتصاميم المرحلة الحالية ، تميل العينة عادة من -60 درجة إلى +60 درجة ، تاركة إسفينا مفقودا21 من المعلومات في إعادة بناء التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد.
إعادة بناء 3D في تصوير قطري واحد ثم إسفين مفقود من المعلومات وإشارة منخفضة إلى الضوضاء. يمكن استخراج الجزيئات الكبيرة الفردية كصور تحت التصوير المقطعي ومتوسطها معا لمعالجة ذلك. عندما يتم العثور على كل جزيء كبير في مخطط تحت التصوير المقطعي في اتجاه مختلف ، يتم توجيه الوتد المفقود بشكل مختلف في كل مخطط فرعي للكائن المستهدف ، لذلك فإن المتوسط على العديد من النسخ يملأ المعلومات بسبب الوتد المفقود. حاولت التطورات الأخيرة في معالجة الصور أيضا تدريب الشبكات العصبية للذكاء الاصطناعي على ملء الإسفين المفقود ببيانات ذات مغزى22. تزيد عملية المتوسط هذه أيضا من الإشارة إلى الضوضاء ، على غرار هدف المتوسط في تحليل الجسيمات المفردة ، وبالتالي تتحسن جودة إعادة الإعمار ودقتها. إذا كان جزيء الاهتمام يمتلك تناظرا ، فقد يتم تعريف ذلك أيضا واستخدامه أثناء المتوسط ، مما يزيد من تحسين دقة إعادة الإعمار. ومن المعروف استخراج أحجام 3D من الجزيء الكبير من التصوير المقطعي إلى مجموعة من subtomograms ومعالجتها اللاحقة باسم المتوسط تحت التصوير المقطعي (STA)23. عندما يمثل كل مخطط فرعي نسخة فريدة من الجزيء قيد الدراسة ، يمكن استجواب أي عدم تجانس هيكلي باستخدام سير عمل STA. وكما هو شائع الاستخدام في سير عمل SPA ، يمكن استخدام تقنيات التصنيف أثناء STA لتشريح الحالات التوافقية لمجمع الاهتمام. بالإضافة إلى STA التي تمكن من إعادة الإعمار عالية الدقة في cryo-ET ، فإن هذا النهج يجعل هذه التقنية أداة قوية لاستجواب الآليات الهيكلية للجزيئات الكبيرة في بيئتها الخلوية الأصلية أو الأهداف التي غالبا ما تكون غير قابلة ل SPA24,25,26.
التصوير المقطعي الإلكتروني لديه تاريخ طويل في تحديد البنية الفائقة 3D للعينات الخلوية في درجة حرارة الغرفة27. يوفر الحصول على وجهات النظر عن طريق الإمالة المادية للعينة معلومات كافية لإعادة بناء 3D لكائن على مقاييس الطول الخلوي ومهم بشكل خاص عندما تفتقر الهياكل الخلوية إلى الانتظام في المتوسط. يمكن أيضا تجميد الخلايا على ركائز للتصوير بالتبريد ET عند حواف الخلية حيث تكون العينة رقيقة بما يكفي لتكون شفافة للإلكترون. في ظل هذه الظروف ، يمكن استخدام STA لتحديد الهياكل الجزيئية الكبيرة في بيئة خلوية ، وإن كان ذلك عندما تكون العينة رقيقة بما يكفي لتكون شفافة للإلكترون28. ومع ذلك ، عندما يقترن بتقنيات تحضيرية إضافية ، بما في ذلك الضوء المبرد المرتبط بالتبريد والمجهر الإلكتروني (cryo-CLEM) وطحن الحزم الأيونية المركزة (cryo-FIB) ، يمكن استخدام cryo-ET للتصوير داخل خلايا كاملة تحت ظروف التبريد29. هذا يجمع بين قوة cryo-ET لدراسة البنية الفائقة الخلوية مع قوة STA لتحديد هياكل المجمعات الجزيئية الكبيرة في الموقع مع تحديد موقعها الخلوي30 وتوفير لقطات من المجمعات المشاركة في العمليات الديناميكية31. وقد أبرزت قدرة هذه التقنية على تصوير العينات الخلوية واستخدام STA في العديد من الدراسات قوة التقنية في حل الهياكل الجزيئية الكبيرة في الموقع ، حتى في درجات دقة مماثلة ل SPA32. تم العثور على فائدة أخرى في معرفة الموقع الأصلي للجزيء الكبير ، ممثلا في إعادة الإعمار 3D المصنفة النهائية في التصوير المقطعي30. لذلك ، يمكن ربط البنية الجزيئية الكبيرة بالبنية الفائقة الخلوية. من المفترض أن تؤدي هذه الملاحظات عبر مقاييس الطول إلى نتائج مهمة حيث قد ترتبط الآليات الهيكلية بالتغيرات الخلوية في سياق الدراسات الوظيفية.
يسمح Cryo-ET و STA بجمع البيانات في ثلاثة مهام سير عمل رئيسية: التصوير المقطعي الجزيئي والخلوي والرقائقي. يمكن تحديد هياكل المجمعات الجزيئية الكبيرة النقية بواسطة cryo-ET بواسطة التصوير المقطعي الجزيئي. يمكن وصف تحديد هياكل البروتين في بيئتها الخلوية حيث تكون الخلية رقيقة بما فيه الكفاية بأنها تصوير مقطعي خلوي. في الآونة الأخيرة ، مع تطوير الاستهداف والطحن المبرد ، يمكن تطبيق هذه التقنيات نفسها في سير عمل التصوير المقطعي الرقائقي لتحديد هياكل البروتين العميقة داخل الخلية في بيئتها الأصلية مع الكشف عن السياق الخلوي الذي يتم فيه ملاحظة هذه البروتينات. يمكن استخدام استراتيجيات مختلفة لجمع البيانات اعتمادا على حزم البرامج المتاحة ، والأهم من ذلك ، اعتمادا على متطلبات العينة. عادة ما تتطلب العينات الجزيئية أو غير الملتصقة على شبكة TEM النحاسية من البروتين النقي معالجة أقل ، وبالتالي تظل مسطحة وغير تالفة في الحالات المثالية. يمكن بسهولة إعداد التصوير المقطعي الإلكتروني في سلسلة عبر شبكة الكربون الثقبي للحصول بسرعة على عشرات إلى مئات من الصور المقطعية بطريقة منهجية. إن أبسط طريقة للمستخدمين لإعداد عينات التصوير المقطعي الجزيئي حيث توجد البروتينات بكثرة على الشبكة هي استخدام Tomo5 (برنامج للتصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد المستخدم في هذه الدراسة ، انظر جدول المواد). تتوفر أيضا برامج التصوير المقطعي الأخرى مثل Leginon9 و serialEM6 ؛ فهي توفر المزيد من خيارات الإعداد لنهج أكثر تخصيصا لجمع البيانات ولكنها أكثر تعقيدا وبالتالي قد يكون من الصعب التنقل فيها ، خاصة بالنسبة للمستخدمين الجدد في التصوير المقطعي والمستخدمين الذين يصلون إلى جلساتهم عن بعد. بالنسبة لمنشأة ذات قاعدة مستخدمين كبيرة ومتنوعة ، من السهل تشغيل Tomo5 في بيئة بعيدة وتدريب المستخدمين عليها. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، تتطلب الشبكات عادة المزيد من خطوات المناولة ، وتزيد الحاجة إلى استخدام شبكات الذهب الهشة من الحاجة إلى رعاية محسنة في استراتيجيات المناولة وجمع البيانات. لتسهيل العثور على منطقة خلوية ذات أهمية وتجنب الانسداد من الشبكة نفسها بزوايا إمالة عالية ، من المفيد أيضا استخدام أحجام شبكية أكبر ، ولكن على حساب أنها أكثر هشاشة بطبيعتها. بالنسبة لعينات الصفيحة ، يتم تحديد هشاشة العينة من خلال جودة الصفيحة ، والتي يمكن أن تكون متغيرة. تزيد هذه العوامل من وقت الإعداد والاعتبارات ، ولكن زيادة القدرة على التكيف والمتانة تجعل Tomo5 مناسبا لهذا النوع من جمع البيانات. ومع ذلك، توجد سيناريوهات متخصصة لجمع البيانات لكل سير عمل. يقدم كل من BISECT و PACE-tomo (كلاهما يعمل في SerialEM) إمكانية تحويل صورة الشعاع النصية أثناء الحصول على التصوير المقطعي لزيادة سرعة جمع التصوير المقطعي28 ، خاصة في التصوير المقطعي الجزيئي. يمكن لمونتاج التكبير المتوسط (MMM) في SerialEM 6,7,33 تحديد الميزات الجزيئية واستهدافها بدقة في جميع مهام سير العمل ، على الرغم من أنه في وقت كتابة هذا التقرير ، بدأت هذه الميزات في التنفيذ في Tomo5.
مثل SPA ، أصبح الوصول إلى cryo-ET و STA متاحا بشكل متزايد من خلال التحسينات التي تم إجراؤها على برامج الاستحواذ ومجموعة كبيرة من الحزم المتاحة للتصوير الشعاعي الفرعي بمتوسط 16،17،32،34،35،36،37،38. بالإضافة إلى ذلك، خلال الجائحة، أصبح تمكين الوصول عن بعد إلى أجهزة التبريد EM أمرا ضروريا لمواصلة تشغيل المرافق الوطنية مثل مركز التصوير الحيوي الإلكتروني (eBIC) في Diamond Light Source (DLS) في المملكة المتحدة. جعلت هذه التطورات cryo-ET أكثر سهولة وقوة للباحثين الراغبين في استخدام هذه التقنية. بمجرد الحصول على البيانات ، تعد STA أداة أساسية لتحليل الأجسام المتكررة للحصول على أقصى قدر من إعادة بناء الدقة والسماح بتصنيف عدم التجانس الجزيئي الكبير. يهدف البروتوكول الحالي إلى توفير جولة مفصلة لإعداد مجهر TEM المبرد لجمع بيانات cryo-ET وكيفية إجراء متوسط التصوير المقطعي الفرعي باستخدام emClarity على مجموعة بيانات التصوير المقطعي الجزيئي للأبوفيريتين كمثال. يتطلب استخدام emClarity (برنامج للتصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون المبرد عالي الدقة ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي ، انظر جدول المواد) تشغيل البرامج النصية من سطر الأوامر ، لذلك يفترض مستوى من الإلمام بأنظمة Linux / UNIX.
يعتمد الاتصال عن بعد على بيئة الشبكة في كل معهد / مرفق. في eBIC ، يستخدم النظام البعيد برامج تسمح بجمع البيانات عن بعد على تكوين الشبكة المحدد المستخدم في Diamond. يتم تسهيل الاتصال عن بعد بالمجهر من خلال منصتين: NoMachine و TeamViewer (انظر جدول المواد). باستخدام البرنامج NoMachine، يمكن للمستخدم تسجيل الدخول إلى سطح مكتب Windows بعيد. يقع سطح مكتب Windows البعيد الذي توفره NoMachine على نفس شبكة المجهر ، وبالتالي ، يعمل كجهاز كمبيوتر دعم افتراضي للمجهر. من جهاز كمبيوتر الدعم الافتراضي ، يتصل المستخدم بالمجهر عبر برنامج TeamViewer مما يوفر الوصول المباشر والتحكم في جهاز الكمبيوتر المجهري الذي يعمل بنظام TUI و Tomo.
ويتألف هذا البروتوكول من جزأين (الخطوة 1 والخطوة 2). تركز الخطوة 1 على الحصول على بيانات cryo-ET عن بعد باستخدام Tomo5 (برنامج للتصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد). يلتقط التجول في جلسة (عن بعد) الصور بتكبيرات أعلى بشكل متزايد للسماح للمستخدم في النهاية بتوجيه برنامج التصوير المقطعي لاستهداف مناطق العينات لجمع البيانات المقطعية. ويلخص الشكل 1 هذه العملية. تفاصيل الخطوة 2 معالجة بيانات cryo-ET STA باستخدام emClarity (برنامج للتصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني عالي الدقة ومتوسط التصوير المقطعي تحت الشكل). ويلخص الشكل 9 هذه العملية.
البروتوكول مخصص للجمهور البعيد. يفترض أن الشخص جسديا في المجهر وتحميل العينات قد قام بالمحاذاة المباشرة واعتنى بضبط الكاميرا واكتساب المرجع. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يفترض وجود نظام عدسة ثلاثي المكثفات مع محمل تلقائي. لمزيد من الإرشادات التفصيلية حول برنامج التصوير المقطعي، يتوفر دليل مفصل من قبل الشركة المصنعة في زر ابدأ في Windows حيث تم تحميل البرنامج منه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

يكتسب التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون (cryo-ET) زخما في السنوات الأخيرة ، خاصة منذ إدخال أجهزة الكشف عن الإلكترونات المباشرة ، وتحسين استراتيجيات الاكتساب الآلي ، والتقنيات التحضيرية التي توسع إمكانيات ما يمكن للمجهر الإلكتروني تصويره بدقة عالية باستخدام cryo-ET وبرنامج متوسط التصوير المقطعي الفرعي الجديد. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح الحصول على البيانات مبسطا بشكل متزايد ، مما يجعلها أكثر سهولة للعديد من المستخدمين. أدت جائحة SARS-CoV-2 إلى تسريع عملية جمع بيانات المجهر الإلكتروني المبرد عن بعد (cryo-EM)، خاصة بالنسبة للجسيم الأحادي الترسب الكهرومغناطيسي، في العديد من المرافق على مستوى العالم، مما يوفر للمستخدم إمكانية الوصول دون انقطاع إلى أحدث الأدوات أثناء الجائحة. مع التطورات الأخيرة في Tomo5 (برنامج التصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد) ، أصبح جمع بيانات cryo-ET عن بعد قويا وسهل التعامل معه من أي مكان في العالم. تهدف هذه المقالة إلى توفير إرشادات تفصيلية، بدءا من إعداد جمع البيانات في برنامج التصوير المقطعي لعملية جلسة جمع بيانات cryo-ET (عن بعد) مع استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل مفصل. يتم استكمال بروتوكول جمع البيانات (عن بعد) بسير العمل لتحديد الهيكل بدقة شبه ذرية بواسطة مخطط فرعي بمتوسط مع emClarity ، باستخدام apoferritin كمثال.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

يصف هذا البروتوكول الحصول على بيانات التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون المقطعي عن بعد عالية الدقة باستخدام Tomo5 ومعالجة البيانات اللاحقة والتصوير المقطعي الفرعي باستخدام emClarity. يستخدم Apoferritin كمثال لتوضيح العمليات التفصيلية خطوة بخطوة لتحقيق بنية cryo-ET بدقة 2.86 Å.

التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جمع البيانات عن بعد ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

يوفر هذا البروتوكول طريقا سهلا للوصول إلى عالم التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد الذي يزداد شعبية ولكنه معقد. يمكن تصوير ست عينات خلوية. معهد في ولاية قريبة من السكان الأصليين.يمكن بعد ذلك حل الجزيئات الدقيقة بدقة عالية في بيئتها الخلوية الأصلية باستخدام CROW و ET ومتوسط الذرة الفرعية. ابدأ بتشغيل برنامج Tomo Five من كمبيوتر خادم TEM. ابدأ الجلسة التي تم إعدادها عن طريق ضبط معلمات الحصول على الصورة في علامة التبويب "إعداد"، ضمن الإعدادات المسبقة.انسخ معلمات الحصول على الصورة إلى جميع الإعدادات المسبقة الأخرى للتكبير العالي. اضغط على Set"لضبط التعرض للمجهر و Get"للحصول على إعدادات التعرض لجميع التكبيرات العالية الأخرى بعد تحديدها بشكل فردي. لجمع أطلس، انقر فوق علامة التبويب جلسة جديدة "في الأطلس".قم بتعيين تفضيلات الجلسة. أدخل مسار التخزين وتنسيق الإخراج واضغط على تطبيق. حدد الفحص"وحدد جميع الأطالس التي سيتم الحصول عليها.حدد إغلاق صمامات الاتصال"إذا كان المجهر غير خاضع للإشراف ، فسيؤدي ذلك إلى إغلاق صمامات العمود. ثم لبدء الفحص، اضغط على زر البدء. افحص الأطالس المفردة أو المتعددة بحثا عن الأهداف من خلال النقر على الشبكة في اللوحة اليمنى ضمن إعداد الجلسة"ثم انقر بزر الماوس الأيسر واسحب الماوس للتنقل والتمرير الأوسط للتكبير والتصغير.اختر الشبكة لإعداد الهدف. حدده وانقر على تحميل عينة"من داخل البرنامج. لإجراء معايرة إزاحة الصورة، في علامة التبويب "وظائف تلقائية"اضبط الإعداد المسبق على ارتفاع Eucentric"انتقل إلى Auto-Eucentric" عن طريق إمالة المرحلة، ثم اضغط على زر البدء.إذا ظلت الميزة متمركزة أثناء الاستهداف، فقم بتخطي معايرات إزاحة الصورة. وإلا، انتقل إلى علامة التبويب "إعداد" لمعايرة إزاحة الصورة، فحدد معايرة إزاحة الصورة"واضغط على زر البدء. سيؤدي ذلك إلى محاذاة التكبيرات المنخفضة مع الميزة المتمركزة عند تكبير التعريض الضوئي.لإعداد التصوير المقطعي ، ابدأ جلسة جديدة في إعداد الجلسة "للعينات البيولوجية. اختر بلاطة مثل"كنوع العينة وحدد الدفعة"والجرعة المنخفضة"ثم حدد مجلد تنسيق الإخراج والتخزين". اختياريا، أضف مستلم بريد إلكتروني واضغط على تطبيق"لإعداد الأهداف، انتقل إلى سهم الأطلس، وابحث عن منطقة اهتمام وتحرك عن طريق تحديد الخيارات التي تنبثق بنقرة مارقة بزر الماوس الأيمن.التقط صورة عامة لتأكيد وضع جيد لضبط الارتفاع Eucentric. ثم اضغط على autoeucentric"لتشغيل eucentric عن طريق روتين إمالة المرحلة ، واستعادة صورة نظرة عامة جديدة لتحديث ارتفاع eucentric. افحص نظرة عامة على المربع أو خريطة البحث التي تم الحصول عليها.انتقل إلى منطقة ذات أهمية واضغط على البحث عن الاكتساب. ثم افحص صورة البحث إذا لم تكن المنطقة ذات الاهتمام متمركزة ، وانقر بزر الماوس الأيمن في الموضع المطلوب وكرر مرحلة النقل هنا"واحصل على صورة. اضبط مناطق التركيز والتتبع.انقر بزر الماوس الأيسر لسحب مناطق التتبع والتركيز. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، اضغط على إضافة موضع"لأداء وظائف تلقائية ، تحقق من الإعدادات لإجراء المحاذاة عبر علامة التبويب Auto Functions" عن طريق التنقل في الأطلس إلى منطقة من الكربون. اجلب هذه المنطقة إلى ارتفاع متمركز واتبع ترتيب المحاذاة كما هو موضح في مخطوطة النص.بعد ذلك ، ابدأ الاكتساب التلقائي لعلامة التبويب التصوير المقطعي. حدد لوح الحصول على البيانات وقم بتعيين المعلمات المطلوبة. إعداد معلمات الحصول على البيانات: خطوة الإمالة ، أقصى زاوية إيجابية ، أقصى زاوية سالبة ، مخطط تتبع.ثم حدد إغلاق صمامات العمود "لنظام الارتفاع eucentric. ابدأ بإعداد ملفات الإدخال والدلائل. إنشاء مجلد مشروع ضمن المجلد "المشروع".قم بعمل مكدسات ثابتة لمجلد جديد آخر وقم بإعداد ملفات الإدخال. سلسلة الإمالة سلسلة إمالة ثابتة واحدة 1. XF وسلسلة الإمالة 1.tlt.لحساب إلغاء التركيز البؤري، قم بتحديث ملف المعلمة باستخدام المجهر ومعلمات التصوير. نسخ ملف معلمة إلى مجلد المشروع. تغيير اسمها إلى param_CTF.M وقم بتشغيل الأمر المشار إليه. بعد ذلك ، تحقق من نتائج تقدير CTF. لكل مكدس ، تحقق من المكدسات المحاذاة باستخدام 3D mod وتأكد من مسح الخرز الائتماني بشكل صحيح.تأكد من صحة اليد عن طريق تشغيل الأمر المشار إليه. ثم تحقق من قيمة إلغاء التركيز البؤري وتأكد من مطابقتها لتقدير CTF النظري. لتحديد المناطق دون الإقليمية، قم بإنشاء تصوير مقطعي منحني.في مجلد المشروع، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. حدد الحدود عن طريق اختيار ست نقاط Xmin Xmax Ymin و Ymax و Zmin و Zmax ، لإنشاء منطقة فرعية واحدة ضمن ملف bin10 ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. بعد ذلك ، قم بتشغيل اختيار الجسيمات لكل منطقة دون إقليمية.بالنسبة لمجموعة بيانات apoferritin ، قم بإجراء بحث عن القالب في bin six. تعديل زاوية تسطير القالب. معلمات البحث لتحديد الزاوية والمدى والفواصل الزمنية للبحث في المستوى أو خارج المستوى بالدرجات.في مجلد المشروع قم بتشغيل الأمر المشار إليه. إزالة الجسيمات غير صحيحة باستخدام 3D mod تحت المجلد. Convmap_wedge_Type2_bin6. قم بتشغيل الأمر المشار إليه.بعد ذلك، قم بتهيئة المشروع. في مجلد المشروع ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه لإنشاء قاعدة بيانات لوضوح EM ، AppoF.mat. قم بإجراء إعادة بناء التصوير المقطعي قبل متوسط التومو الفرعي والمحاذاة لإنشاء صور مقطعية مصححة للمنطقة الفرعية CTF في bin4 ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه.بعد ذلك ، لإجراء متوسط ومحاذاة تومو فرعي ، قم بإجراء المتوسط باستخدام البرقيات الفرعية المصححة CTF بدءا من bin4. في مجلد المشروع، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. استمر في إجراء المحاذاة وقم بتشغيل الأمر.نظف الجسيمات المتداخلة عن طريق تشغيل الأمر المشار إليه. قم بإجراء إعادة الإعمار النهائية من خلال الجمع بين مجموعتي البيانات النصفيتين. في مجلد المشروع قم بتشغيل الأوامر المشار إليها.يتم عرض نظرة عامة على سير عمل التصوير المقطعي للتصوير المقطعي الخلوي والجزيئي هنا للعينات الخلوية والصفائحية ، وتعتمد استراتيجية جمع البيانات إلى حد كبير على العينة والهدف من دراسة التصوير. يتم عرض معلمات المجموعة للعديد من دراسات cryo ET هنا. يتم عرض الصور المقطعية التمثيلية للعينات الجزيئية مثل الأبوفيريتين ، والعمليات الخلوية الرقيقة ، والصفيحة المطحونة بالحزمة الأيونية المركزة للعينة الخلوية السميكة هنا.يمكن أن يساعد التحليل الهيكلي عالي الدقة في الكشف عن مواقع ملزمة لأهداف الأدوية ، كما ساعد التصوير المقطعي والمتوسط دون التوموغريال في تطوير لقاح ضد SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

أخذ عينات مياه البحر وكوكتيل

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

جمع وتحديد حبوب اللقاح من مستعمرات نحل العسل

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

جمع البيانات المجهرية للإضاءة المهيكلة بالتبريد من الخلايا المحفوظة بالتبريد

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

بناء نموذج هيكلي واقعي للخيول كامل الجسم ثلاثي الأبعاد باستخدام بيانات التصوير المقطعي المحوسب

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...