Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Vi anerkender Diamond Light Source for adgang til og støtte til cryo-EM-faciliteterne på Storbritanniens nationale Electron Bio-Imaging Center (eBIC), finansieret af Wellcome Trust, MRC og BBRSC. Vi vil også gerne takke Andrew Howe for erhvervelsen af Apoferritin-tomogrammet (film 1), Ishika Kumar for forberedelsen og erhvervelsen af neurontomogrammet (film 2) og Craig MacGregor-Chatwin for cyanobakterierne lamel-tomogrammet (film 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Tomo5 Arbejdsgangsbeskrivelsen af tomografisoftwaren fremhæver en potentiel og mest strømlinet måde til en (fjern) batchtomografisessionsopsætning. Mens softwaren er let for begyndere, kan nogle indledende cryo-EM-erfaringer og grundlæggende tomografiforståelse hjælpe med opsætningen. Kritiske trin er fremhævet i protokollen og bør hjælpe med fejlfinding, selvom der er brugt en anden opsætningsmetode. Udviklingen af softwaren vil lette (fjern) dataindsamling og gøre cryo-ET mere tilgængelig for en bred brugerbase. Et par tip og tricks, der kan hjælpe med at fejlfinde almindeligt opståede problemer, er beskrevet nedenfor.
Et vigtigt punkt at diskutere er valget af gitre, fordi gitterstænger ved høje hældninger kan skjule visningen, når prøven vippes til ±60 ° (figur 8). På et TEM-gitter refererer maskestørrelsen til antallet af gitterkvadrater pr. Enhedslængde af gitteret. Større maskenumre har flere gitterkvadrater pr. Enhedslængde, en højere tæthed af gitterkvadrater og mindre gitterkvadrater, dvs. et gitter med 400 mesh har mindre kvadrater end et 200-maskegitter. Et godt valg af gitter til tomografi er 200-mesh eller 300-mesh gitter. Som vist i figur 8 reduceres det tilgængelige område til indsamling, efterhånden som gitteret vippes. Ved ±60° hældning vil et gitter med 300 mesh have et lille synsfelt, hvorpå der kan erhverves et fuldt tomogram. Fordelene ved 200-mesh gitter er, at de større gitterfirkanter gør molekylær tomografiopsætning hurtigere, og med det øgede gitter-kvadratareal vil en firkant sandsynligvis være nok til en overnatningssamling. Ulempen er, at 200-mesh gitter er mere skrøbelige, så håndtering og klipning kræver mere finesse.
Hvis der anvendes hulstøttefilm (se Materialetabel) på EM-gitre, skal hulafstanden desuden tages i betragtning ved opsætning af fokus- og sporingsområdet i forhold til eksponeringsområdet. Ideelt set bør strålediameteren ved den ønskede forstørrelse være lille nok til at dække kulstofområdet ved siden af eksponeringsområdet langs hældningsaksen for optimal og hurtig opsætning. På denne måde kan potentielle regioner af interesse for hvert hul erhverves.
Da softwarens eucentriske højderutine i øjeblikket ikke er så robust, såsom serialEM-rutinen, kan følgende tip løse dette problem. Hvis den eucentriske højdebestemmelse mislykkes ved hjælp af den eucentriske højdeforudindstilling, kan man bruge oversigtsforudindstillingen i stedet og køre "Auto-eucentrisk ved trinhældning" igen; Dette kan løse problemer, hvis den eucentriske højde er langt væk fra 0. Hvis dette lykkes, kan man køre "Auto-eucentrisk by stage tilt" med "Eucentric Height" forudindstillinger for at forbedre præcisionen. Hvis det mislykkes, kan man køre "Auto-Eucentric by beam tilt" med den eucentriske højdeforudindstilling og derefter køre "Auto-Eucentric by stage tilt" eller manuelt indstille z-højden konsolideret af "Auto-Eucentric by beam tilt" i TEM-brugergrænsefladen under "Stage" -indstillinger. Hvis der anvendes gitre med et gentagende mønster af huller, kan de forhindre identifikation af en enkelt krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en lavere defokusforskydning såsom -25 μm og / eller en kortere eksponeringstid for at reducere krydskorrelation fra hulmønstrene. På den anden side giver brug af lacey grids / lameller muligvis ikke tilstrækkeligt signal til en stærk krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en større defokusforskydning såsom -75 μm og / eller en forlænget eksponeringstid for at forbedre krydskorrelationstoppen. En anden mulighed er at justere billedfilterindstillinger; de findes på fanen "Forberedelse". Indstillinger til justering af filterindstillingerne kan indstilles for lav (Oversigt / Gridsquare), medium (eucentrisk højde) og høj forstørrelse (sporing / fokus) for at finde den optimale krydskorrelationstop for hver forudindstilling. Det krævede input er et billede, dvs. ved 0° og et ved 5°, efterfulgt af at klikke på Sammenlign for at sammenligne begge billeder. Den anbefalede startværdi for den længste bølgelængde er en fjerdedel af skalalinjen på billedet og for den korteste bølgelængde en fyrretyvendedel af skalalinjen. Hvis toppen ikke er robust identificeret, kan man optimere indstillingerne, indtil der kan findes en overbevisende top. Der er ingen grund til at generhverve billeder hver gang; det er nok blot at trykke på "Sammenlign". Hvis TOMO stadig ikke automatisk kan finde den eucentriske højde, kan den manuelle eucentriske højdekalibrering anvendes. Man skal centrere over en rimelig stor iskrystal i oversigtsforstørrelse på fanen "Forberedelse", derefter gå til "Stage-kontrollen" i TEM-brugergrænsefladen, indstille alfa til -30 ° og justere trin z-værdien for at centrere krystallen igen ved hjælp af det fluorescerende skærmbillede. Hvis du vælger indstillingerne "Høj opløsning" og "Høj kontrast" i TEM-brugergrænsefladen, bliver dette enkelt (knapper nederst i det fluorescerende skærmvindue). Eventuelt, hvis der er adgang til et kamera med live-tilstand, kan dette bruges til at bestemme den eucentriske højde; Det bliver lettere end på den fluorescerende skærm.
De største begrænsninger i Tomo5-versioner før 5.8 er de manglende mellemforstørrelsesmontager, manglende dosissymmetrisk skema og problemer relateret til eucentrisk højdefinding. Disse findes i serialEM, et freeware med hurtig udvikling og fællesskabsstøtte, en robust eucentrisk højderutine og muligheden for at scripte, dvs. et specialbygget dosissymmetrisk skema. Fra version 5.8 og fremefter i Tomo5 er det mest almindeligt forekommende problem med at finde den eucentriske højde, dvs. en mislykket looping omkring målet z-værdi, blevet løst ved at implementere muligheden for at indstille et eucentrisk højdeacceptkriterium. Men med forskellige gitter- og prøvetyper anbefales det stærkt at justere billedfilterindstillingerne for at afspejle de unikke billeddannelsesbetingelser for individuelle sessioner og for at give den bedst mulige krydskorrelationstop for at finde den eucentriske højde og for fokus- og sporingsområdet at fungere pålideligt under tomogramoptagelse.

Samlet set har mange faciliteter hurtigt tilpasset sig fjerndrift under pandemien. Tomo5-softwaren giver en nem adgang og brugervenlig rute til tomografi, som er velegnet til fjernbetjening. De fremskridt, der er gjort i softwaren, vil uden tvivl fortsætte med at gøre fjerndataindsamlinger og tomografiindsamling generelt mere mainstream i samfundet.
emKlarhed Da emClarity bruger en skabelonbaseret partikelplukningsmetode, har den brug for en skabelon til objektet af interesse. Partikelplukningen (trin 2.6) er meget følsom og nøglen til den endelige struktur. Før gennemsnit og justering (trin 2.9) skal man sørge for at kontrollere omhyggeligt og manuelt fjerne de falske positiver. Når en skabelon ikke er tilgængelig, er emClarity muligvis ikke let at bruge, men det er muligt at bruge anden software, for eksempel Dynamo37 og PEET48, til at oprette en indledende model.
For heterogene prøver er emClarity udstyret med en klassificeringsmetode, der gør det muligt for brugerne at fokusere på specifikke funktioner med forskellige skalaer. Det er nyttigt at køre et par cyklusser med justeringer før klassificering og køre det ved en højere binning (såsom skraldespand 4 eller skraldespand 3).
Den opdaterede version af softwaren (V1.5.3.11) har betydelige opdateringer sammenlignet med den første version (V1.0)17. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, en håndsrækningskontrol under CTF-estimering (trin 2.3); symmetri for justeringer (CX, I, I2, O); beregning af 3D-prøveudtagningsfunktioner pr. partikel (3DSF) et skift til MATLAB 2019a for kompatibilitet og stabilitet; og rekonstruktion ved hjælp af de rå projektionsbilleder (cisTEM). Softwaren vil fortsætte med at forbedre for forskellige prøver, og de nyeste meddelelser kan findes online (se Materialetabel).

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er almindeligt kendt for at have oplevet en renæssanceperiode, der fremskynder den til at blive et centralt og centralt nyttigt værktøj i strukturel biologi. Udvikling og udnyttelse af direkte elektrondetektorer 1,2,3, forbedrede mikroskoper og elektronkilder 3,4,5, forbedringer i automatisering / gennemstrømning 6,7,8,9 og beregningsmæssige fremskridt inden for enkeltpartikelanalyse10,11,12,13 ,14 og tomografi15,16,17 er alle delvist ansvarlige for teknikkens nylige succes. Disse teknologiske drivkræfter har udviklet cryo-EM's evne til at løse biologiske makromolekylære strukturer under kryogene og indfødte forhold. De opløsninger, der er let tilgængelige, er tilstrækkelige til atomnøjagtig modellering og har bragt teknikken i spidsen for den strukturelle biologiske arena. En reduktionistisk tilgang til at udtrykke og rense et biologisk mål af interesse har længe vist sig at være vellykket inden for makromolekylær krystallografi (MX) til grundlæggende biologisk forskning, lægemiddelopdagelse og translationel videnskab. I samme tilgang kan cryo-EM nu levere resultater, der er parallelle MX-studier med høj opløsning. Den nuværende store succes i cryo-EM-grenen af strukturbiologi kaldes enkeltpartikelanalyse (SPA), som erhverver 2D-projektionsbilleder typisk af et renset proteinprøve18 for at opnå tusindvis af visninger af et biologisk makromolekyle19. Disse billeder (1) indeholder information fra en række synspunkter, der fuldt ud repræsenterer målets orienteringer i 3D-rummet og (2) fanger objektets konformationelle heterogenitet, som senere kan adskilles og undersøges.
En alternativ tilgang til at erhverve disse 2D-projektionsbilleder af biologiske prøver, selv in situ og uden oprensning, er kryo-elektrontomografi (cryo-ET). Cryo-ET tager en række billeder af det samme objekt i skrå vinkler ved mekanisk at rotere prøven. Således indsamles de 2D-fremskrivninger, der er indsamlet i SPA, der repræsenterer vinkelstillingerne for det interessante molekyle, i sagens natur som en del af cryo-ET-billeddannelseseksperimentet20. Tomografiske vippeserier rekonstrueres derefter til et tomogram, der indeholder 3D-repræsentationer af de afbildede makromolekylære komplekser. Arten af tomografisk dataindsamling mindsker til en vis grad afhængigheden af gennemsnit for at opnå en fuld 3D-repræsentation af et molekyle fra en samling af 2D-billeder. På grund af nuværende scenedesign vippes prøven imidlertid typisk fra -60 ° til +60 °, hvilket efterlader en manglende kile21 af information i den tomografiske 3D-rekonstruktion.
3D-rekonstruktionerne i et enkelt tomogram har derefter en manglende kile af information og lavt signal til støj. Individuelle makromolekyler kan ekstraheres som subtomogrammer og gennemsnit sammen for at tackle dette. Hvor hvert makromolekyle i et subtomogram findes i en anden retning, er den manglende kile orienteret forskelligt i hvert subtomogram af målobjektet, så gennemsnit over mange kopier udfylder information på grund af den manglende kile. Den seneste udvikling inden for billedbehandling har også forsøgt at træne neurale netværk med kunstig intelligens til at udfylde den manglende kile med meningsfulde data22. Denne gennemsnitsproces øger også signalet til støj, svarende til målet om gennemsnit i enkeltpartikelanalyse, så rekonstruktionens kvalitet og opløsning forbedres. Hvis molekylet af interesse har symmetri, kan det også defineres og anvendes under gennemsnittet, hvilket yderligere forbedrer rekonstruktionsopløsningen. Ekstraktionen af 3D-volumener af et makromolekyle fra et tomogram til et sæt subtomogrammer og deres efterfølgende behandling er kendt som subtomogram averaging (STA)23. Hvor hvert subtomogram repræsenterer en unik kopi af molekylet, der undersøges, kan enhver strukturel heterogenitet forhøres ved hjælp af STA-arbejdsgangen. Som almindeligt anvendt i SPA-arbejdsgangen kan klassificeringsteknikker anvendes under STA til at dissekere konformationstilstandene i interessekomplekset. Ud over at STA muliggør rekonstruktion i høj opløsning i cryo-ET, gør denne tilgang teknikken til et kraftfuldt værktøj til at forhøre de strukturelle mekanismer for makromolekyler i deres oprindelige cellulære miljø eller af mål, der ofte ikke er modtagelige for SPA24,25,26.
Elektrontomografi har en lang historie med at bestemme 3D-ultrastrukturen af cellulære prøver ved stuetemperatur27. Erhvervelsen af visninger ved fysisk hældning af prøven giver tilstrækkelig information til 3D-rekonstruktionen af et objekt på cellelængdeskalaer og er især vigtigt, når cellulære strukturer mangler regelmæssigheden for gennemsnit. Celler kan også fryses på substrater til cryo-ET-billeddannelse ved cellekanterne, hvor prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig. Under disse forhold kan STA anvendes til at bestemme makromolekylære strukturer i et cellulært miljø, omend når prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig28. Men når det kombineres med yderligere forberedende teknikker, herunder kryokorrelativ lys- og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB), kan cryo-ET bruges til at afbilde inde i hele celler under kryogene forhold29. Dette samler kraften i cryo-ET til at studere den cellulære ultrastruktur med kraften i STA til at bestemme strukturerne af makromolekylære komplekser in situ , samtidig med at de identificerer deres cellulære placering30 og giver snapshots af komplekser, der er involveret i dynamiske processer31. Teknikkens evne til at afbilde cellulære prøver og anvende STA i flere undersøgelser har fremhævet teknikkens evne til at løse makromolekylære strukturer in situ , selv ved opløsninger, der kan sammenlignes med SPA32. En yderligere fordel findes i kendskabet til makromolekylets oprindelige placering, repræsenteret ved den endelige klassificerede 3D-rekonstruktion i tomogrammet30. Derfor kan den makromolekylære struktur korreleres med den cellulære ultrastruktur. Disse observationer på tværs af længdeskalaer vil formodentlig føre til vigtige fund, hvor strukturelle mekanismer kan korreleres med cellulære ændringer i forbindelse med funktionelle undersøgelser.
Cryo-ET og STA tillader dataindsamling i tre store arbejdsgange: molekylær, cellulær og lameltomografi. Strukturerne af oprensede makromolekylære komplekser kan bestemmes ved kryo-ET ved molekylær tomografi. Bestemmelse af proteinstrukturer i deres cellulære miljø, hvor cellen er tynd nok, kan beskrives som cellulær tomografi. For nylig, med udviklingen af kryogen målretning og fræsning, kan de samme teknikker anvendes i lamellatomografiarbejdsgange for at bestemme proteinstrukturerne dybt inde i cellen i deres oprindelige miljø, samtidig med at de afslører den cellulære kontekst, hvori disse proteiner observeres. Forskellige dataindsamlingsstrategier kan bruges afhængigt af de tilgængelige softwarepakker og vigtigst af alt afhængigt af prøvens krav. Molekylære eller ikke-klæbende prøver på et kobber TEM-gitter af et oprenset protein kræver typisk mindre håndtering og forbliver således fladt og ubeskadiget i ideelle tilfælde. Elektrontomogrammer kan let opsættes i serie på tværs af et hul-kulstofgitter for hurtigt at erhverve titusinder til hundredvis af tomogrammer på en systematisk måde. Den enkleste måde for brugerne at oprette molekylære tomografiprøver, hvor proteiner er rigeligt til stede på nettet, ville være at bruge Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi, der anvendes i denne undersøgelse, se Materialetabel). Anden tomografisoftware såsom Leginon9 og serialEM6 er også tilgængelig; De tilbyder flere opsætningsmuligheder for mere personlige tilgange til dataindsamling, men er mere komplekse og kan derfor være sværere at navigere, især for brugere, der er nye inden for tomografi, og brugere, der får adgang til deres session eksternt. For et anlæg med en stor og forskelligartet brugerbase er Tomo5 let at betjene i et fjernmiljø og at træne brugere i. For klæbende celler kræver gitre typisk flere håndteringstrin, og nødvendigheden af at bruge skrøbelige guldgitter øger behovet for forbedret pleje i håndterings- og dataindsamlingsstrategier. For at gøre det lettere at finde et cellulært område af interesse og undgå okklusion fra selve gitteret ved høje hældningsvinkler, er det også en fordel at bruge større maskestørrelser, men til den pris, at de i sagens natur er mere skrøbelige. For lamellaprøver bestemmes prøvens skrøbelighed af lamellens kvalitet, som kan varieres. Disse faktorer øger opsætningstiden og overvejelserne, men den øgede tilpasningsevne og robusthed gør igen Tomo5 velegnet til denne type dataindsamling. Der findes dog specialiserede dataindsamlingsscenarier for hver arbejdsproces. BISECT og PACE-tomo (begge kørt i SerialEM) introducerer muligheden for scriptet strålebilledskift under tomografioptagelse for at øge tomogramindsamlingshastigheden28, især i molekylær tomografi. Medium forstørrelsesmontager (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bedre identificere og præcist målrette molekylære funktioner i alle arbejdsgange, selvom disse funktioner i skrivende stund begynder at blive implementeret i Tomo5.
Ligesom SPA bliver cryo-ET og STA mere og mere tilgængelige gennem forbedringerne af erhvervelsessoftware og et væld af tilgængelige pakker til subtomogram i gennemsnit 16,17,32,34,35,36,37,38. Derudover blev det under pandemien vigtigt at muliggøre fjernadgang til cryo-EM-instrumentering for den fortsatte drift af nationale faciliteter som electron Bio-Imaging Centre (eBIC) ved Diamond Light Source (DLS), Storbritannien. Denne udvikling har gjort cryo-ET mere tilgængelig og robust for forskere, der ønsker at udnytte teknikken. Når data er erhvervet, er STA et vigtigt værktøj til analyse af tilbagevendende objekter for at opnå rekonstruktion med maksimal opløsning og muliggøre klassificering af makromolekylær heterogenitet. Den nuværende protokol har til formål at give en detaljeret gennemgang af forberedelsen af et kryo-TEM-mikroskop til cryo-ET-dataindsamling, og hvordan man udfører subtomogramgennemsnit ved hjælp af emClarity på et molekylært tomografidatasæt af apoferritin som et eksempel. Brugen af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit, se Tabel over materialer) kræver kørsel af scripts fra kommandolinjen, så der antages et niveau af fortrolighed med Linux/UNIX-systemer.
Fjernforbindelsen afhænger af netværksmiljøet i hvert institut/facilitet. Hos eBIC bruger fjernsystemet programmer, der tillader fjerndataindsamling på den specifikke netværkskonfiguration, der bruges hos Diamond. Fjernforbindelse til mikroskopet lettes af to platforme: NoMachine og TeamViewer (se Materialetabel). Ved hjælp af programmet NoMachine kan brugeren logge på et eksternt Windows-skrivebord. Det eksterne Windows-skrivebord leveret af NoMachine ligger på samme netværk som mikroskopet og fungerer således som en virtuel support-pc til mikroskopet. Fra den virtuelle support-pc opretter brugeren forbindelse til mikroskopet via TeamViewer, der giver direkte adgang og kontrol til mikroskop-pc'en, der kører TUI og Tomo.
Den nuværende protokol består af to dele (trin 1 og trin 2). Trin 1 fokuserer på ekstern cryo-ET-dataindsamling ved hjælp af Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi). Gennemgangen til en (fjern) session tager billeder med stadig højere forstørrelser for i sidste ende at give brugeren mulighed for at dirigere tomografisoftwaren til at målrette prøveområder til tomografisk dataindsamling. Figur 1 opsummerer denne proces. Trin 2 beskriver cryo-ET STA-databehandling ved hjælp af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit). Figur 9 opsummerer denne proces.
Protokollen er beregnet til et fjernpublikum. Det forudsætter, at personen fysisk ved mikroskopet og indlæsning af prøverne har foretaget de direkte justeringer og taget sig af kameraindstillingen og fået referenceoptagelse. Til denne protokol antages et trekondensatorlinsesystem med en autoloader. For yderligere detaljerede retningslinjer for tomografisoftwaren er en detaljeret manual fra producenten tilgængelig i Windows Start-knappen, hvor softwaren blev indlæst fra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

Cryo-elektrontomografi (cryo-ET) har fået fart i de senere år, især siden introduktionen af direkte elektrondetektorer, forbedrede automatiserede erhvervelsesstrategier, forberedende teknikker, der udvider mulighederne for, hvad elektronmikroskopet kan afbilde i høj opløsning ved hjælp af cryo-ET og ny subtomogram gennemsnitssoftware. Derudover er dataindsamling blevet mere og mere strømlinet, hvilket gør det mere tilgængeligt for mange brugere. SARS-CoV-2-pandemien har yderligere fremskyndet indsamling af eksterne kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), især for enkeltpartikel cryo-EM, i mange faciliteter globalt, hvilket giver uafbrudt brugeradgang til avancerede instrumenter under pandemien. Med de seneste fremskridt inden for Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi) er fjernindsamling af cryo-ET-data blevet robust og nem at håndtere fra hvor som helst i verden. Denne artikel har til formål at give en detaljeret gennemgang, startende fra dataindsamlingsopsætningen i tomografisoftwaren til processen med en (fjern) cryo-ET-dataindsamlingssession med detaljeret fejlfinding. Den (fjerntliggende) dataindsamlingsprotokol suppleres yderligere med arbejdsgangen til strukturbestemmelse ved nær-atomopløsning ved subtomogram gennemsnit med emClarity ved hjælp af apoferritin som et eksempel.

For cellulære prøver og lamelprøver afhænger dataindsamlingsstrategien i vid udstrækning af prøven og målet med billeddannelsesundersøgelsen (figur 1). Målretningsmetoden afhænger af, om det molekylære mål er in situ eller fremstillet ud fra det oprensede makromolekylære kompleks til rekonstruktionsprøver med høj opløsning, der indeholder molekylære mål. For oprensede komplekser, der er forglasset på hullede (kulstof) gitter, kan målretning simpelthen baseres på billeddannelse i hullerne i (kulstof) støttefilmen. For in situ-arbejde kræver målretningsmetoden viden om placeringen af den molekylære enhed baseret på korrelative data eller kendte cellulære vartegn med lav forstørrelse. Cellulære vartegn vil ideelt set være identificerbare, når du tager oversigtsbilleder, og hvis det er tilstrækkeligt til groft at lokalisere regioner af interesse, kan det give en hurtig måde at bekræfte målidentitet med et søgebillede. Men hvis de observerbare hændelser er sjældne, kan det være nødvendigt med søgebilleder med medium forstørrelse for at kvalificere, at målet er korrekt. Søgekort er mellemstore forstørrelsesmontager af søgebilleder og kan således gøre målfinding meget lettere, hvor de kan erhverves ved en forstørrelse, hvor funktionen af interesse er synlig. Søgekort kan derefter screenes for at finde og konfigurere målbatchpositioner. For prøver, der indeholder cellulære træk til ultrastrukturel rekonstruktion, er målretningsmetoden ens, men lige så afhængig af synligheden af den cellulære begivenhed ved forskellige forstørrelser og dens udbredelse i prøven.
Dataindsamlingsstrategien skal også overvejes; I alle tilfælde bestemmer undersøgelsens mål i vid udstrækning, hvordan dataene indsamles. Til rekonstruktion af den cellulære ultrastruktur kan en lav forstørrelse (20-5 Å / px) og stort synsfelt være passende, men høje forstørrelser er nødvendige for at rekonstruere molekylære eller højopløselige detaljer (5-1 Å / px). Et datasæt indsamlet ved 1,5 Å/px under ideelle forhold vil kun fysisk kunne producere en rekonstruktion ved Nyquist-frekvensen på 3,0 Å/px; Men i virkeligheden påvirker mange faktorer, herunder men ikke begrænset til prøvetykkelse, størrelse og heterogenitet, alle den opnåede rekonstruktionskvalitet. De nøjagtige billeddannelsesparametre balancerer også forstørrelsen baseret på undersøgelsens mål med synsfeltet til at indeholde tilstrækkelig information. Denne artikel præsenterer et subtomogram gennemsnit tilfælde, der når 2,86 Å, men yderligere undersøgelser 17,42,43,44,45 er præsenteret i tabel 1 for at illustrere indsamlingsparametrene forbundet med undersøgelser rettet mod forskellige resultater17,42,45,46.
Når en målretningsarbejdsgang og dataindsamlingsregime for cryo-ET er etableret, er dataindsamling af mange forskellige prøvetyper mulig. Repræsentative tomogrammer af en række prøver præsenteres her: molekylære prøver såsom apoferritin (film 1), tynde cellulære processer (film 2) og FIB-fræset lamell af den tykke cellulære prøve (film 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over opsætningen af tomografiarbejdsgangen. Den cryo-ET-billedbehandlingsarbejdsgang, der er beskrevet i protokollen, vises som et rutediagram. De billeder, der forventes at blive erhvervet, vises for den cellulære og molekylære arbejdsgang. Den præsenterede navngivning følger Tomo5-konventionen, selvom de fleste tomografioptagelsessoftware deler fælles principper for indsamling af disse billeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Figur 2: Fanen Forberedelse og betingelser for forudindstilling af søgning . (A) Oversigtsbillede af hele fanen. Forudindstillinger for billedtilstand er indstillet i denne fane, og "Kalibrer billedskift" og "Indstillinger for billedfilter" kan findes i rullemenuen "Opgaver". (B) Zoom ind på rullemenuen "Forudindstillinger", hvor hver forudindstilling kan vælges til individuel opsætning af billedbetingelser. (C) Billede, der viser en passende forstørrelse, der passer til både eksponeringen og området "Fokus og sporing" i synsfeltet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figur 3: Dosisberegninger. Eksempel på dosisberegninger for mulige tomogramoptagelsesordninger, hvor dosishastigheden er målt over vakuum. De to beregninger bestemmer eksponeringstiden(e) for hver hældning, uanset om den sigter mod en optimal dosis pr. hældning eller en optimal totaldosis for full tilt-serien. I subtomogramgennemsnit er det almindelig praksis at målrette en optimal dosis pr. vippet billede i intervallet 3,0-3,5 e-/Å2. I begge tilfælde er "Brøker (nr.)" indstillet til 6 for at opnå ~0,5 e-/Å2 dosis pr. filmramme af hældningen for tilstrækkeligt signal til at udføre bevægelseskorrektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Figur 4: Fanen Atlas. Oversigtsbillede af fanen "Atlas". Billedet er blevet beskåret for at undgå tomme gitterpositionsrum. Menuen "Opgaver" indeholder indstillinger for sessionsopsætning og gittervalgsrum til individuel udvælgelse af alle registrerede gitre og en mulighed for at erhverve et enkelt atlas, efter at kassetten er fjernet fra autoloaderen. Et valgt gitter kan nulstilles og derefter hentes igen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Figur 5: Kalibrerede billedskift. Billedet viser et eksponerings- og søgebillede. Det røde kryds i søgebilledet er den skiftede markør for at korrigere forskydningen mellem eksponering og søgning. Man bør gentage kalibreringer af billedskift ved sessionsstart eller efter ændring af forudindstillingerne for billedtilstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Figur 6: Automatiske funktioner og blænder . (A) Fanen "Autofunktioner" viser rullemenuen "Forudindstillinger" og valget "Opgave". Understreget med blåt er den forudindstilling "Thon Ring", der kræves for "Autostigmate" (også understreget med blåt) og "Autocoma". Man skal vælge de respektive forudindstillinger for hver opgave og derefter trykke på Start-knappen . (B) Blænder findes i TEM-brugergrænsefladen. Vælg ønsket "Objektiv blænde", efter at de automatiske funktioner er udført, og kør "Autostigmate" med blænden i. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Figur 7: Oversigt over fanen Tomografi. Billeder viser Tomo 5.8-brugergrænsefladen. (A) Batchpositioner. De seneste funktioner, der er afbildet på billedet: indstillingen "Acquire Search Map"; Tomogrampositioner vises i Atlas-visning med zoom-in-indstillingen; fremhævet øverst til højre er "Vælg positioner"; nedenfor er alle fire positioner valgt til parametrene "Opdater defokusering". (B) Tre positioner vælges på søgekortet, mærket 1, 2 og 3. Position 1 vil ikke udgøre et problem, når "Forfin alle" køres. Men hvis der i en indstilling med høj måltæthed, f.eks. når der vælges lamellerpositioner, som afbildet for position 2 og position 3, vil "Forfine alle" køre rutinen "Sporing" og "Fokus" på "Eksponering" -regionen i position 2 og udsætte målet, før tomogrammet erhverves. Gittertypen er R1.2/1.3. Skalalinje = 1,2 μm. (C) Dataindsamling. Udvalgte stillinger i "Batchpositioner" kan nu erhverves individuelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Figur 8: Definition af den maksimale hældningsvinkel. Figuren viser en trinvis tilgang til bestemmelse af det maksimale hældningsområde for tomogramanskaffelser. (A) 0° oversigt og et søgekort i midten af gitterfirkanten. For at teste hældningsområdet kan vinklen indstilles i tomografisoftwaren med "Set Tilt (°)" ved at skrive den ønskede værdi og derefter trykke på Indstil. (B) Trinnet er blevet vippet til -60°, hvilket viser, at et hjørne af søgekortet ikke ville være fuldt ud erhvervet ved -60°. (C) Scenen er vippet til 60°. Ved at tælle de huller, der er forsvundet ved ±60°, kan man få en idé om vippeområdet for en gitterfirkant. Skalabjælker = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Figur 9: emClarity flowchart. Flowdiagrammet beskrev de forskellige trin for cryo sub-tomogram gennemsnit. Skala søjler = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Figur 10: Skabelonmatchning ved hjælp af emClarity . (A) En typisk mikrograf af apoferritin på et grafenbelagt gitter. Defokusering: -3.430 μm. (B) Et stykke af tomogrammet overlejret med modelpunkter efter skabelonsøgning. (C) En top og (D) en sideprojektionsvisning af modelpunkter, der angiver et enkelt fladt lag af monodisperserede apoferritinpartikler. Skala søjler = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figur 11: Cryo-ET STA af apoferritin . (A) Det endelige kort efter 21 cyklusser med justering af undertomogram. (B) Det endelige korts Fourier-skalkorrelation (FSC) plot med en rapporteret opløsning på 2,86 Å, der indeholder 38 kegle-FSC'er. (C) Repræsentative tæthedskort (udstyret med PDB-model 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prøve</td>
			<td>Cryo-ET-typen</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Hældningsområde (+/-)</td>
			<td>Vip trin (°)</td>
			<td>Defokuseringsområde (μm)</td>
			<td>Total dosis (e-/Å2)</td>
			<td>Opløsning</td>
			<td>Rådata</td>
			<td>Henvisning</td>
		</tr><tr><td>Apoferritin</td>
			<td>Oprenset/molekylær (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & dette papir</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 Gag</td>
			<td>Oprenset/molekylær (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosom</td>
			<td>Oprenset/molekylær (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>SARS-CoV-2 spids</td>
			<td>Lamell/Molekylær (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Neuron axon struktur</td>
			<td>Cellulær (ultrastrukturel)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Indsamlingsparametre for flere cryo-ET-undersøgelser. Undersøgelser rettet mod rekonstruktion af molekylære detaljer fra oprensede eller in situ-proteiner sammenlignet med en undersøgelse, der sigter mod at løse og segmentere de ultrastrukturelle cellulære træk.
Film 1: Et tomogram af apoferritinprøver på et normalt EM-gitter og derefter afbildet med en cryo-TEM udstyret med et ultrahøjopløsningskamera med et kompatibelt filter. Tilt-serien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 54° og en total dosis på 134 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne film.</a>
Film 2: Et tomogram af en primær neuron dyrket på et EM-gitter og derefter direkte afbildet med en cryo-TEM udstyret med et ultrahøjopløsningskamera med et kompatibelt filter. Vippeserien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 60° og en total dosis på 120 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne film.</a>
Film 3: Et tomogram af en cyanobakterie på et EM-gitter, udsat for FIB-fræsning og derefter afbildet med en cryo-TEM udstyret med et højhastighedskamera og et kompatibelt filter. Vippeserien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 50° og en total dosis på 120 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne film.</a>
Supplerende fil 1: Parameterfilskabelonen til estimering af defokusering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 1: Oplysninger om dataindsamling og mikroskopopsætning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2: Liste over kommandoer i udførelsesrækkefølgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Den nuværende protokol beskriver højopløsnings kryo-elektrontomografi fjerndataindsamling ved hjælp af Tomo5 og efterfølgende databehandling og subtomogram gennemsnit ved hjælp af emClarity. Apoferritin bruges som et eksempel til at illustrere detaljerede trin-for-trin processer for at opnå en cryo-ET-struktur ved 2,86 Å opløsning.

Cryo-elektron tomografi Fjerndataindsamling og subtomogram gennemsnit

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Denne protokol giver en nem adgangsvej ind i den stadig mere populære, men komplekse verden af kryoelektrontomografi. Seks cellulære prøver kan afbildes. Institut i en tæt på indfødt stat.Mikromolekyler kan derefter løses ved høj opløsning i deres oprindelige cellulære miljø ved hjælp af CROW, ET og sub atom averaging. Begynd med at starte Tomo fem software fra TEM server pc. Start sessionsopsætningen ved at justere billedoptagelsesparametrene under forberedelsesfanen under forudindstillinger.Kopier parametrene for billedoptagelse til alle de andre forudindstillinger for høj forstørrelse. Tryk på Indstil "for at indstille eksponering for mikroskopet og Hent" for at få eksponeringsindstillingerne til alle andre høje forstørrelser efter at have valgt dem individuelt. For at indsamle et atlas skal du klikke på den nye session"i Atlas"fanen.Indstil sessionspræferencerne. Indtast lagringsstien og outputformatet, og tryk på Anvend. Vælg Screening"og marker alle de atlasser, der skal erhverves.Vælg Luk opkaldsventiler"Hvis mikroskopet er uden opsyn, lukker dette søjleventilerne. Tryk derefter på startknappen for at starte screeningen. Undersøg de enkelte eller flere atlasser for mål ved at klikke på gitteret i venstre panel under Sessionsopsætning"Venstreklik derefter og træk musen for at bevæge sig rundt og midterste rulle for at zoome ind og ud.Vælg gitteret til målopsætningen. Vælg det, og klik på Indlæs prøve "inde fra softwaren. For at udføre kalibrering af billedskift skal du under fanen Autofunktioner"indstille forudindstillingen til Eucentrisk højde"Naviger til Auto-Eucentrisk"efter trinhældning, og tryk på start.Hvis funktionen forblev centreret under målretning, skal du springe kalibreringerne af billedskift over. Ellers skal du gå til fanen Forberedelse "til kalibrering af billedskift vælg Kalibrer billedskift"og tryk på start. Dette vil justere lavere forstørrelser til funktionen centreret ved eksponeringsforstørrelse.For opsætning af tomografi skal du starte en ny session i Sessionsopsætning "for biologiske prøver. Vælg Plade som"som prøvetype, og vælg Batch"og lav dosis"Vælg derefter mappen Outputformat og opbevaring". Tilføj eventuelt en e-mail-modtager og tryk på Anvend"For at oprette mål skal du gå til atlaspilen, finde et interesseområde og flytte ved at vælge de indstillinger, der dukker op med et højre museklik.Tag et oversigtsbillede for at bekræfte en god position til eucentrisk højdejustering. Tryk derefter på autoeucentrisk"for at køre den eucentriske ved trinhældningsrutine, generhverve et nyt oversigtsbillede for at opdatere den eucentriske højde. Undersøg den firkantede oversigt eller det erhvervede søgekort.Flyt til et område af interesse, og tryk på anskaf søgning. Undersøg derefter søgebilledet, hvis interesseområdet ikke er centreret, højreklik på den ønskede position og gentag Flyt-scenen her "og få billede. Juster fokus- og sporingsområderne.Venstreklik for at trække sporings- og fokusområderne. Når alle parametre er indstillet, skal du trykke på Tilføj position"For at udføre automatiske funktioner skal du kontrollere indstillingerne for at udføre justeringerne via fanen Autofunktioner" ved at navigere atlaset til et område med kulstof. Bring dette område til eucentrisk højde og følg rækkefølgen af justeringer som beskrevet i tekstmanuskriptet.Start derefter den automatiserede erhvervelse af tomografifanen. Vælg dataindsamlingspladen ud og indstil de ønskede parametre. Konfigurer dataindsamlingsparametre: vippetrin, maksimal positiv vinkel, maksimal negativ vinkel, sporingsskema.Vælg derefter Luk søjleventiler"til det eucentriske højdeskema. Start med at forberede inputfiler og mapper. Opret en projektmappe under mappen Projekt".Lav en anden ny mappe faste stakke og forbered inputfilerne. Tilt serie et fast vippe serie 1. XF og tilt serie 1.tlt.For at beregne defokuseringen skal du opdatere parameterfilen med mikroskopet og billeddannelsesparametrene. Kopier en parameterfil til projektmappen. Skift navn til param_CTF.M og kør den angivne kommando. Kontroller derefter CTF-estimeringsresultaterne. For hver stak skal du kontrollere de justerede stakke ved hjælp af 3D-mod og sikre, at fiducialperlerne slettes korrekt.Sørg for, at håndskriften er korrekt ved at køre den angivne kommando. Kontroller derefter defokuseringsværdien, og sørg for, at den matcher det teoretiske CTF-estimat. For at definere underregionerne skal du generere et bøjningstomogram.Kør den angivne kommando i projektmappen. Bestem grænserne ved at vælge seks punkter Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin og Zmax, for at oprette en underregion under mappebakken10, kør den angivne kommando. Kør derefter partikelplukning for hver underregion.For apoferritindatasættet udføres en skabelonsøgning på bin six. Rediger skabelonens understregningsvinkel. Søg efter parametre for at bestemme vinkel, rækkevidde og intervaller for søgning i plan eller ud af plan i grader.I projektmappen køres den angivne kommando. Fjern de forkerte partikler ved hjælp af 3D-mod under mappen. Convmap_wedge_Type2_bin6. Kør den angivne kommando.Derefter initialiseres projektet. I projektmappen køres den angivne kommando for at oprette en database til EM-klarhed, AppoF.mat. Udfør tomogramrekonstruktion før sub tomo gennemsnit og justering for at generere CTF-korrigerede underregion-tomogrammer ved bin4, kør den angivne kommando.For at udføre sub tomo-gennemsnit og justering skal du derefter udføre gennemsnittet ved hjælp af CTF-korrigerede undertelegrammer, der starter ved bin4. Kør den angivne kommando i projektmappen. Fortsæt med at foretage justeringer, og kør kommandoen.Rengør de overlappede partikler ved at køre angivet kommando. Udfør den endelige rekonstruktion ved at kombinere de to halve datasæt. I projektmappen køres de angivne kommandoer.Oversigt over tomografiarbejdsgangen for cellulær og molekylær tomografi er vist her for cellulære og lamelprøver, dataindsamlingsstrategien afhænger stort set af prøven og målet med billeddannelsesundersøgelsen. Indsamlingsparametre for flere cryo ET-undersøgelser er vist her. Repræsentative tomogrammer af molekylære prøver såsom apoferritin, tynde cellulære processer og fokuseret ionstrålefræset lamella af den tykke cellulære prøve er vist her.Strukturel analyse i høj opløsning kan hjælpe med at afsløre bindingssteder for lægemiddelmål, og tomografi og sub-tomogral gennemsnit har også hjulpet vaccineudvikling mod SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-Electron Microscopy Prøvepræparation ved hjælp af en målrettet Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

SKAL og MÅ af Cryo-elektronmikroskopi: En primer på Prøveforberedelse og data af høj kvalitet Indsamling til Macromolecular 3D Genopbygning

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Indsamling og identifikation af pollen fra honningbikolonier

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Kryo-elektron mikroskopisk gitter forberedelse til tid-løste undersøgelser ved hjælp af en ny robot system, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Kryo-struktureret belysning Mikroskopisk dataindsamling fra kryogent bevarede celler

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Konstruktion af en realistisk, helkrops, tredimensionel hesteskeletalmodel ved hjælp af computertomografidata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier for optimering af kryogene Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Prøveforberedelse ved 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til kryo-elektrontomografi med høj opløsning

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...