Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

We erkennen Diamond Light Source voor toegang tot en ondersteuning van de cryo-EM-faciliteiten in het nationale Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) in het Verenigd Koninkrijk, gefinancierd door de Wellcome Trust, MRC en BBRSC. We willen ook Andrew Howe bedanken voor de aankoop van het Apoferritin-tomogram (film 1), Ishika Kumar voor de voorbereiding en verwerving van het neurontomogram (film 2) en Craig MacGregor-Chatwin voor het Cyanobacteria lamella-tomogram (film 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Tomo5 De workflowbeschrijving van de tomografiesoftware belicht een potentiële en meest gestroomlijnde manier voor een (externe) batchtomografiesessie-instelling. Hoewel de software gemakkelijk is voor beginners, kan enige initiële cryo-EM-ervaring en basistomografie-inzicht helpen bij de installatie. Kritieke stappen worden gemarkeerd in het protocol en moeten helpen bij het oplossen van problemen, zelfs als een andere instellingsaanpak is gebruikt. De vooruitgang van de software zal het verzamelen van (externe) gegevens vergemakkelijken en cryo-ET toegankelijker maken voor een breed gebruikersbestand. Een paar tips en trucs die kunnen helpen bij het oplossen van veelvoorkomende problemen worden hieronder beschreven.
Een belangrijk punt om te bespreken is de keuze van rasters, omdat bij het kantelen van het monster tot ±60°, rasterbalken bij hoge kantelen het zicht kunnen belemmeren (figuur 8). Op een TEM-raster verwijst de maaswijdte naar het aantal rastervierkanten per eenheidslengte van het raster. Grotere maasnummers hebben meer rastervierkanten per lengte-eenheid, een hogere dichtheid van rastervierkanten en kleinere rastervierkanten, d.w.z. een raster met 400 mazen heeft kleinere vierkanten dan een raster met 200 mazen. Een goede keuze aan rasters voor tomografie is rasters met 200 mazen of 300 mazen. Zoals te zien is in figuur 8, wordt het beschikbare gebied om te verzamelen verkleind naarmate het raster wordt gekanteld. Bij ±60° kanteling heeft een raster van 300 mesh een klein gezichtsveld waarop een volledig tomogram kan worden verkregen. De voordelen van rasters met 200 mazen zijn dat de grotere rastervierkanten de moleculaire tomografie sneller opzetten, en met het grotere raster-vierkante gebied zal één vierkant waarschijnlijk voldoende zijn voor een nachtelijke verzameling. Het nadeel is dat 200-mesh roosters kwetsbaarder zijn, dus handling en clipping vereisen meer finesse.
Bovendien moet bij het gebruik van gatachtige steunfolie (zie Materiaaltabel) op EM-rasters rekening worden gehouden met de gatafstand voor het instellen van het focus- en volggebied in relatie tot het belichtingsgebied. Idealiter moet de straaldiameter bij de gewenste vergroting klein genoeg zijn om het koolstofgebied naast het blootstellingsgebied langs de kantelas te bedekken voor een optimale en snelle installatie. Op deze manier kunnen potentiële regio's van belang in elk gat worden verkregen.
Omdat de eucentrische hoogteroutine van de software momenteel niet zo robuust is, zoals de serialEM-routine, kunnen de volgende tips dat probleem omzeilen. Als de eucentrische hoogtebepaling mislukt met behulp van de eucentrische hoogtevoorinstelling, kan men in plaats daarvan de overzichtsvoorinstelling gebruiken en "Auto-eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren; dit kan problemen oplossen als de eucentrische hoogte ver weg is van 0. Als dit lukt, kan men "Auto-eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren met "Eucentric Height" presets om de precisie te verbeteren. Als het mislukt, kan men "Auto-Eucentric by beam tilt" uitvoeren met de eucentrische hoogtevoorinstelling en vervolgens "Auto-Eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren of handmatig de z-hoogte instellen geconsolideerd door "Auto-Eucentric by beam tilt" in de TEM-gebruikersinterface onder "Stage" instellingen. In het geval dat rasters met een herhalend patroon van gaten worden gebruikt, kunnen ze de identificatie van een enkele kruiscorrelatiepiek voorkomen. Men kan proberen de eucentrische hoogtevoorinstelling te wijzigen in een lagere onscherpteverschuiving zoals −25 μm en/of een kortere belichtingstijd om de kruiscorrelatie van de gatpatronen te verminderen. Aan de andere kant kan het gebruik van lacey grids / lamellen niet voldoende signaal geven voor een sterke cross-correlatie piek. Men kan proberen de eucentrische hoogtevoorinstelling te wijzigen in een grotere onscherpteverschuiving zoals −75 μm en/of een langere belichtingstijd om de kruiscorrelatiepiek te verbeteren. Een andere optie is om de instellingen van het afbeeldingsfilter aan te passen; ze zijn te vinden in het tabblad "Voorbereiding". Opties om de filterinstellingen aan te passen kunnen worden ingesteld voor laag (Overzicht/Rasterplein), gemiddeld (Eucentrische Hoogte) en hoge vergroting (Tracking/Focus) om de optimale kruiscorrelatiepiek voor elke voorinstelling te vinden. De vereiste invoer is één afbeelding, d.w.z. op 0° en één op 5°, gevolgd door op Vergelijken te klikken om beide afbeeldingen te vergelijken. De aanbevolen beginwaarde voor de langste golflengte is een kwart van de schaalbalk in de afbeelding en voor de kortste golflengte is een veertigste van de schaalbalk. Als de piek niet robuust wordt geïdentificeerd, kan men de instellingen optimaliseren totdat een overtuigende piek kan worden gevonden. Het is niet nodig om afbeeldingen elke keer opnieuw te verwerven; gewoon op "Vergelijken" drukken is voldoende. Als TOMO er nog steeds niet in slaagt om automatisch de eucentrische hoogte te vinden, kan de handmatige eucentrische hoogtekalibratie worden gebruikt. Men moet centreren over een redelijk groot ijskristal in overzichtsvergroting in het tabblad "Voorbereiding", ga dan naar de "Stage control" van de TEM-gebruikersinterface, stel alfa in op −30 °, en pas de fase z-waarde aan om het kristal opnieuw te centreren met behulp van het fluorescerende schermbeeld. Het selecteren van de instellingen "Hoge resolutie" en "Hoog contrast" in de TEM-gebruikersinterface maakt dit eenvoudig (knoppen onder aan het fluorescerende schermvenster). Optioneel, als er toegang is tot een camera met live-modus, kan dit worden gebruikt om de eucentrische hoogte te bepalen; het zal gemakkelijker zijn dan op het fluorescerende scherm.
De grootste beperkingen in Tomo5-versies vóór 5.8 zijn de ontbrekende mediumvergrotingsmontages, ontbrekende dosissymmetrisch schema en problemen met betrekking tot eucentrische hoogtebepaling. Deze bestaan in serialEM, een freeware met snelle ontwikkeling en community-ondersteuning, een robuuste eucentrische hoogteroutine en de optie om te scripten, d.w.z. een op maat gemaakt dosissymmetrisch schema. Vanaf versie 5.8 in Tomo5 is het meest voorkomende probleem voor het vinden van de eucentrische hoogte, d.w.z. een mislukte lus rond de doelz-waarde, opgelost door de optie te implementeren om een eucentrisch hoogteacceptatiecriterium in te stellen. Bij verschillende raster- en monstertypen wordt het echter ten zeerste aanbevolen om de beeldfilterinstellingen aan te passen aan de unieke beeldomstandigheden van individuele sessies en om de best mogelijke kruiscorrelatiepiek te geven om de eucentrische hoogte te vinden en om het focus- en trackinggebied betrouwbaar te laten werken tijdens tomogramacquisitie.

Over het algemeen hebben veel faciliteiten zich snel aangepast aan bediening op afstand tijdens de pandemie. De Tomo5-software biedt een gemakkelijke toegang en gebruiksvriendelijke route naar tomografie die zeer geschikt is voor bediening op afstand. De vooruitgang die in de software is geboekt, zal ongetwijfeld doorgaan met het op afstand verzamelen van gegevens en tomografie in het algemeen meer mainstream in de gemeenschap.
emClarity Omdat emClarity een op sjablonen gebaseerde deeltjesverzamelmethode gebruikt, heeft het een sjabloon nodig voor het object van interesse. De deeltjespluk (stap 2.6) is zeer gevoelig en bepalend voor de uiteindelijke structuur. Alvorens het gemiddelde te nemen en uit te lijnen (stap 2.9), moet men ervoor zorgen dat de valse positieven zorgvuldig en handmatig worden verwijderd. Wanneer een sjabloon niet beschikbaar is, is emClarity misschien niet gemakkelijk te gebruiken, maar het is mogelijk om andere software te gebruiken, bijvoorbeeld Dynamo37 en PEET48, om een eerste model te maken.
Voor heterogene monsters is emClarity uitgerust met een classificatiemethode waarmee gebruikers zich kunnen concentreren op specifieke functies met verschillende schalen. Het is handig om een paar cycli van uitlijningen uit te voeren voordat u deze classificeert en deze uit te voeren op een hogere binning (zoals bin 4 of bin 3).
De up-to-date versie van de software (V1.5.3.11) heeft belangrijke updates in vergelijking met de eerste release (V1.0)17. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, een handvaardigheidscontrole tijdens CTF-schatting (stap 2.3); symmetrie voor uitlijningen (CX, I, I2, O); berekening van 3D-bemonsteringsfuncties per deeltje (3DSF); een overstap naar MATLAB 2019a voor compatibiliteit en stabiliteit; en reconstructie met behulp van de onbewerkte projectiebeelden (cisTEM). De software zal blijven verbeteren voor verschillende voorbeelden en de nieuwste aankondigingen zijn online te vinden (zie Tabel met materialen).

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is algemeen bekend om een renaissanceperiode te hebben meegemaakt, waardoor het een kern en centraal bruikbaar hulpmiddel in de structurele biologie werd. De ontwikkeling en het gebruik van directe elektronendetectoren 1,2,3, verbeterde microscopen en elektronenbronnen 3,4,5, verbeteringen in automatisering/doorvoer 6,7,8,9 en computationele vooruitgang in analyse van enkele deeltjes 10,11,12,13 ,14 en tomografie 15,16,17 zijn allemaal gedeeltelijk verantwoordelijk voor het recente succes van de techniek. Deze technologische drivers hebben het vermogen van cryo-EM ontwikkeld om biologische macromoleculaire structuren op te lossen onder cryogene en inheemse omstandigheden. De resoluties die gemakkelijk te verkrijgen zijn, zijn voldoende voor atomair nauwkeurige modellering en hebben de techniek naar de voorgrond van de structurele biologie arena gebracht. Een reductionistische benadering van het uitdrukken en zuiveren van een biologisch doelwit van belang is al lang succesvol gebleken in macromoleculaire kristallografie (MX) voor fundamenteel biologisch onderzoek, medicijnontdekking en translationele wetenschap. In dezelfde aanpak kan cryo-EM nu resultaten leveren die parallel lopen met MX-studies met hoge resolutie. Het huidige grote succes in de cryo-EM-tak van de structurele biologie wordt single particle analysis (SPA) genoemd, waarbij 2D-projectiebeelden worden verkregen die typisch zijn voor een gezuiverd eiwitmonster18 om duizenden weergaven van een biologisch macromolecuul te verkrijgen19. Deze afbeeldingen (1) bevatten informatie uit een reeks weergaven die de oriëntaties van het doelwit in de 3D-ruimte volledig weergeven en (2) leggen de objectconformatie heterogeniteit vast, die later kan worden gescheiden en onderzocht.
Een alternatieve benadering voor het verkrijgen van deze 2D-projectiebeelden van biologische monsters, zelfs in situ en zonder zuivering, is cryo-elektronentomografie (cryo-ET). Cryo-ET maakt een reeks beelden van hetzelfde object onder gekantelde hoeken door het monster mechanisch te roteren. De 2D-projecties verzameld in SPA, die de hoekige poses van het molecuul van belang vertegenwoordigen, worden dus inherent verzameld als onderdeel van het cryo-ET-beeldvormingsexperiment20. Tomografische tilt-reeksen worden vervolgens gereconstrueerd tot een tomogram dat 3D-representaties van de afgebeelde macromoleculaire complexen bevat. De aard van tomografische gegevensverzameling vermindert tot op zekere hoogte de afhankelijkheid van middeling om een volledige 3D-weergave van een molecuul uit een verzameling 2D-afbeeldingen te bereiken. Vanwege de huidige faseontwerpen wordt het monster echter meestal gekanteld van −60° tot +60°, waardoor er een ontbrekende wig21 aan informatie overblijft in de tomografische 3D-reconstructie.
De 3D-reconstructies in een enkel tomogram hebben dan een ontbrekende wig van informatie en een laag signaal naar ruis. Individuele macromoleculen kunnen als subtomogrammen worden geëxtraheerd en samen worden gemiddeld om dit aan te pakken. Waar elk macromolecuul in een subtomogram in een andere oriëntatie wordt gevonden, is de ontbrekende wig in elk subtomogram van het doelobject anders georiënteerd, dus gemiddeld over vele kopieën vult informatie in vanwege de ontbrekende wig. Recente ontwikkelingen in beeldverwerking hebben ook geprobeerd om neurale netwerken van kunstmatige intelligentie te trainen om de ontbrekende wig op te vullen met zinvolle gegevens22. Dit middelingsproces verhoogt ook het signaal naar ruis, vergelijkbaar met het doel van middeling in analyse van enkele deeltjes, zodat de kwaliteit en resolutie van de reconstructie verbeteren. Als het molecuul van belang symmetrie bezit, kan ook dat worden gedefinieerd en gebruikt tijdens het middelen, waardoor de reconstructieresolutie verder wordt verbeterd. De extractie van 3D-volumes van een macromolecuul uit een tomogram in een reeks subtomogrammen en de daaropvolgende verwerking ervan staat bekend als subtomogrammiddeling (STA)23. Wanneer elk subtomogram een unieke kopie van het bestudeerde molecuul vertegenwoordigt, kan elke structurele heterogeniteit worden ondervraagd met behulp van de STA-workflow. Zoals vaak gebruikt in de SPA-workflow, kunnen classificatietechnieken tijdens STA worden gebruikt om de conformatietoestanden van het complex van belang te ontleden. Naast STA die reconstructie met hoge resolutie in cryo-ET mogelijk maakt, maakt deze aanpak de techniek een krachtig hulpmiddel om de structurele mechanismen van macromoleculen in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving of van doelen die vaak niet vatbaar zijn voor SPA 24,25,26 te ondervragen.
Elektronentomografie heeft een lange geschiedenis van het bepalen van de 3D-ultrastructuur van cellulaire monsters bij kamertemperatuur27. Het verkrijgen van weergaven door het fysiek kantelen van het monster biedt voldoende informatie voor de 3D-reconstructie van een object op cellulaire lengteschalen en is vooral belangrijk wanneer cellulaire structuren de regelmaat voor gemiddelden missen. Cellen kunnen ook worden ingevroren op substraten voor cryo-ET-beeldvorming aan de celranden waar het monster dun genoeg is om elektrontransparantie te zijn. Onder deze omstandigheden kan STA worden gebruikt om macromoleculaire structuren in een cellulaire omgeving te bepalen, zij het wanneer het monster dun genoeg is om elektrontransparant te zijn28. In combinatie met aanvullende voorbereidende technieken, waaronder cryocorrelatieve licht- en elektronenmicroscopie (cryo-CLEM) en gefocusseerd ionenbundelfrezen (cryo-FIB), kan cryo-ET echter worden gebruikt om in hele cellen onder cryogene omstandigheden in beeld tebrengen 29. Dit brengt de kracht van cryo-ET samen om de cellulaire ultrastructuur te bestuderen met de kracht van STA om de structuren van macromoleculaire complexen in situ te bepalen, terwijl hun cellulaire locatiewordt geïdentificeerd 30 en snapshots worden gemaakt van complexen die betrokken zijn bij dynamische processen31. Het vermogen van de techniek om cellulaire specimens in beeld te brengen en STA in verschillende studies te gebruiken, heeft de kracht van de techniek benadrukt om macromoleculaire structuren in situ op te lossen, zelfs bij resoluties die vergelijkbaar zijn met SPA32. Een ander voordeel wordt gevonden in de kennis van de oorspronkelijke locatie van het macromolecuul, vertegenwoordigd door de uiteindelijke geclassificeerde 3D-reconstructie in het tomogram30. Daarom kan de macromoleculaire structuur worden gecorreleerd met de cellulaire ultrastructuur. Deze waarnemingen over lengteschalen zullen vermoedelijk leiden tot belangrijke bevindingen waarbij structurele mechanismen kunnen worden gecorreleerd met cellulaire veranderingen in de context van functionele studies.
Cryo-ET en STA maken gegevensverzameling mogelijk in drie belangrijke workflows: moleculaire, cellulaire en lamellentomografie. De structuren van gezuiverde macromoleculaire complexen kunnen worden bepaald door cryo-ET door moleculaire tomografie. Het bepalen van eiwitstructuren in hun cellulaire omgeving waar de cel dun genoeg is, kan worden beschreven als cellulaire tomografie. Meer recent, met de ontwikkeling van cryogene targeting en frezen, kunnen dezelfde technieken worden toegepast in lamellatomografieworkflows om de eiwitstructuren diep in de cel in hun oorspronkelijke omgeving te bepalen en tegelijkertijd de cellulaire context te onthullen waarin die eiwitten worden waargenomen. Verschillende strategieën voor gegevensverzameling kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbare softwarepakketten en, belangrijker nog, afhankelijk van de vereiste van het specimen. Moleculaire of niet-hechtende monsters op een koperen TEM-rooster van een gezuiverd eiwit vereisen doorgaans minder behandeling en blijven dus plat en onbeschadigd in ideale gevallen. Elektronentomogrammen kunnen eenvoudig in serie worden opgezet over een gatachtig koolstofraster om snel tientallen tot honderden tomogrammen op een systematische manier te verkrijgen. De eenvoudigste manier voor gebruikers om moleculaire tomografiemonsters op te zetten waar eiwitten overvloedig aanwezig zijn op het raster, zou zijn om Tomo5 te gebruiken (software voor 3D-elektronentomografie die in deze studie wordt gebruikt, zie Tabel van materialen). Andere tomografiesoftware zoals Leginon9 en serialEM6 zijn ook beschikbaar; ze bieden meer installatieopties voor meer gepersonaliseerde benaderingen voor gegevensverzameling, maar zijn complexer en kunnen daarom moeilijker te navigeren zijn, vooral voor gebruikers die nieuw zijn bij tomografie en gebruikers die op afstand toegang hebben tot hun sessie. Voor een faciliteit met een groot en divers gebruikersbestand is Tomo5 eenvoudig te bedienen in een externe omgeving en om gebruikers in te trainen. Voor aanhangende cellen vereisen rasters doorgaans meer verwerkingsstappen en de noodzaak om fragiele gouden rasters te gebruiken, verhoogt de behoefte aan verbeterde zorg bij het omgaan met en verzamelen van gegevens. Om het vinden van een interessant cellulair gebied te vergemakkelijken en occlusie van het raster zelf bij hoge kantelhoeken te voorkomen, is het ook gunstig om grotere maaswijdten te gebruiken, maar ten koste van het feit dat ze inherent kwetsbaarder zijn. Voor lamellenmonsters wordt de kwetsbaarheid van het monster bepaald door de kwaliteit van de lamellen, die variabel kan zijn. Deze factoren verhogen de insteltijd en overwegingen, maar het toegenomen aanpassingsvermogen en de robuustheid maken Tomo5 weer geschikt voor dit type gegevensverzameling. Er bestaan echter gespecialiseerde scenario's voor gegevensverzameling voor elke workflow. BISECT en PACE-tomo (beide uitgevoerd in SerialEM) introduceren de mogelijkheid van gescripte bundelbeeldverschuiving tijdens tomografie-acquisitie om de snelheid van de tomogramverzameling te verhogen28, met name in moleculaire tomografie. Medium vergrotingsmontages (MMM) in SerialEM 6,7,33 kunnen moleculaire functies in alle workflows beter identificeren en nauwkeurig targeten, hoewel deze functies op het moment van schrijven beginnen te worden geïmplementeerd in Tomo5.
Net als SPA worden cryo-ET en STA steeds toegankelijker door de verbeteringen aan acquisitiesoftware en een schat aan beschikbare pakketten voor subtomogrammen met een gemiddelde van 16,17,32,34,35,36,37,38. Bovendien werd tijdens de pandemie het mogelijk maken van externe toegang tot cryo-EM-instrumentatie essentieel voor de voortzetting van de werking van nationale faciliteiten zoals het Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) in Diamond Light Source (DLS), VK. Deze ontwikkelingen hebben cryo-ET toegankelijker en robuuster gemaakt voor onderzoekers die de techniek willen gebruiken. Zodra gegevens zijn verkregen, is STA een essentieel hulpmiddel voor het analyseren van terugkerende objecten om reconstructie met maximale resolutie te verkrijgen en de classificatie van macromoleculaire heterogeniteit mogelijk te maken. Het huidige protocol is bedoeld om een gedetailleerde walk-through te geven van het voorbereiden van een cryo-TEM-microscoop voor cryo-ET-gegevensverzameling en hoe subtomogrammiddeling kan worden uitgevoerd met behulp van emClarity op een moleculaire tomografie-dataset van apoferritine als voorbeeld. Het gebruik van emClarity (software voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie en subtomogrammiddeling, zie Materiaaltabel) vereist het uitvoeren van scripts vanaf de opdrachtregel, dus er wordt uitgegaan van een mate van vertrouwdheid met Linux/UNIX-systemen.
De externe verbinding is afhankelijk van de netwerkomgeving in elk instituut/faciliteit. Bij eBIC maakt het externe systeem gebruik van programma's die het mogelijk maken om op afstand gegevens te verzamelen over de specifieke netwerkconfiguratie die bij Diamond wordt gebruikt. Verbinding op afstand met de microscoop wordt mogelijk gemaakt door twee platforms: NoMachine en TeamViewer (zie Materiaaltabel). Met behulp van het programma NoMachine kan de gebruiker inloggen op een extern Windows-bureaublad. Het externe Windows-bureaublad van NoMachine bevindt zich op hetzelfde netwerk als de microscoop en fungeert dus als een virtuele ondersteunings-pc voor de microscoop. Vanaf de virtuele ondersteunings-pc maakt de gebruiker verbinding met de microscoop via TeamViewer en biedt directe toegang en controle tot de microscoop-pc met TUI en Tomo.
Het huidige protocol bestaat uit twee delen (stap 1 en stap 2). Stap 1 richt zich op cryo-ET data-acquisitie op afstand met behulp van Tomo5 (software voor 3D-elektronentomografie). De walk-through voor een (externe) sessie legt beelden vast met steeds hogere vergrotingen om de gebruiker uiteindelijk in staat te stellen de tomografiesoftware te richten op specimengebieden voor tomografische gegevensverzameling. Figuur 1 vat dit proces samen. Stap 2 beschrijft cryo-ET STA-gegevensverwerking met behulp van emClarity (software voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie en subtomogrammiddeling). Figuur 9 vat dit proces samen.
Het protocol is bedoeld voor een extern publiek. Het gaat ervan uit dat de persoon fysiek bij de microscoop en het laden van de monsters de directe uitlijningen heeft gedaan en heeft gezorgd voor de cameraafstemming en gain-referentie-acquisitie. Voor dit protocol wordt uitgegaan van een driecondensorlenssysteem met een autoloader. Voor meer gedetailleerde richtlijnen over de tomografiesoftware is een gedetailleerde handleiding van de fabrikant beschikbaar in de Windows Start-knop van waaruit de software is geladen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is de laatste jaren in een stroomversnelling geraakt, vooral sinds de introductie van directe elektronendetectoren, verbeterde geautomatiseerde acquisitiestrategieën, voorbereidende technieken die de mogelijkheden uitbreiden van wat de elektronenmicroscoop met hoge resolutie kan fotograferen met behulp van cryo-ET en nieuwe subtomogrammiddelingssoftware. Bovendien is data-acquisitie steeds gestroomlijnder geworden, waardoor het voor veel gebruikers toegankelijker is geworden. De SARS-CoV-2-pandemie heeft de externe cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) gegevensverzameling verder versneld, vooral voor cryo-EM met één deeltje, in veel faciliteiten wereldwijd, waardoor gebruikers tijdens de pandemie ononderbroken toegang hebben tot state-of-the-art instrumenten. Met de recente ontwikkelingen in Tomo5 (software voor 3D-elektronentomografie) is cryo-ET-gegevensverzameling op afstand robuust en gemakkelijk te hanteren vanaf elke locatie ter wereld. Dit artikel is bedoeld om een gedetailleerde walk-through te bieden, te beginnen met de gegevensverzamelingsopstelling in de tomografiesoftware voor het proces van een (externe) cryo-ET-gegevensverzamelingssessie met gedetailleerde probleemoplossing. Het (remote) dataverzamelingsprotocol wordt verder aangevuld met de workflow voor structuurbepaling bij near-atomaire resolutie door subtomogrammiddeling met emClarity, met apoferritine als voorbeeld.

Voor cellulaire en lamellenmonsters hangt de strategie voor gegevensverzameling grotendeels af van het monster en het doel van het beeldvormingsonderzoek (figuur 1). De targetingbenadering hangt af van het feit of het moleculaire doelwit in situ is of bereid uit het gezuiverde macromoleculaire complex voor reconstructiemonsters met hoge resolutie die moleculaire doelen bevatten. Voor gezuiverde complexen die op gaten (koolstof) roosters worden verglaasd, kan targeting eenvoudig worden gebaseerd op beeldvorming in de gaten van de (koolstof) ondersteuningsfilm. Voor in situ werk vereist de targetingbenadering kennis van de locatie van de moleculaire entiteit op basis van correlatieve gegevens of bekende cellulaire oriëntatiepunten met lage vergroting. Cellulaire oriëntatiepunten zouden idealiter identificeerbaar zijn bij het maken van overzichtsfoto's en, indien voldoende om regio's van belang ruwweg te lokaliseren, een snelle manier kunnen bieden om de doelidentiteit te bevestigen met een zoekafbeelding. Als de waarneembare gebeurtenissen echter zeldzaam zijn, kunnen zoekafbeeldingen met gemiddelde vergroting nodig zijn om te kwalificeren dat het doel correct is. Zoekkaarten zijn medium vergrotingsmontages van zoekafbeeldingen en kunnen dus het vinden van doelen veel gemakkelijker maken, waar ze kunnen worden verkregen bij een vergroting waarbij het interessante kenmerk zichtbaar is. Zoekkaarten kunnen vervolgens worden gescreend om doelbatchposities te vinden en in te stellen. Voor specimens die cellulaire kenmerken voor ultrastructurele reconstructie bevatten, is de targetingbenadering vergelijkbaar, hoewel even afhankelijk van de zichtbaarheid van de cellulaire gebeurtenis bij verschillende vergrotingen en de prevalentie ervan in het monster.
Er moet ook rekening worden gehouden met de data-acquisitiestrategie; in alle gevallen bepaalt het doel van het onderzoek grotendeels hoe de gegevens worden verzameld. Voor reconstructie van de cellulaire ultrastructuur kunnen een lage vergroting (20-5 Å/px) en een groot gezichtsveld geschikt zijn, maar hoge vergrotingen zijn vereist om moleculaire of hoge resolutiedetails (5-1 Å/px) te reconstrueren. Een dataset verzameld op 1,5 Å/px onder ideale omstandigheden zal alleen fysiek een reconstructie kunnen produceren met de Nyquist-frequentie van 3,0 Å/px; in werkelijkheid hebben echter veel factoren, waaronder maar niet beperkt tot de dikte, grootte en heterogeniteit van het specimen, allemaal invloed op de verkregen reconstructiekwaliteit. De exacte beeldparameters balanceren ook de vergroting op basis van het doel van de studie met het gezichtsveld om voldoende informatie te bevatten. Dit artikel presenteert een subtomogram met een gemiddelde van 2,86 Å, maar aanvullende studies 17,42,43,44,45 worden gepresenteerd in tabel 1 om de verzamelparameters te illustreren die verband houden met studies gericht op verschillende uitkomsten17,42,45,46.
Zodra een doelgerichte workflow en data-acquisitieregime voor cryo-ET is vastgesteld, is gegevensverzameling van veel verschillende monstertypen mogelijk. Representatieve tomogrammen van een verscheidenheid aan specimens worden hier gepresenteerd: moleculaire monsters zoals apoferritine (film 1), dunne cellulaire processen (film 2) en FIB-gemalen lamellen van het dikke cellulaire monster (film 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de configuratie van de tomografieworkflow. De cryo-ET imaging workflow beschreven in het protocol wordt weergegeven als een stroomdiagram. De beelden die naar verwachting zullen worden verkregen, worden getoond voor de cellulaire en moleculaire workflow. De gepresenteerde naamgeving volgt de Tomo5-conventie, hoewel de meeste tomografie-acquisitiesoftware gemeenschappelijke principes deelt voor het verzamelen van deze afbeeldingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbereidingstabblad en vooraf ingestelde zoekcondities. (A) Overzichtsafbeelding van het hele tabblad. Voorinstellingen voor beeldcondities worden op dit tabblad ingesteld en de "Calibrate Image Shift" en "Image Filter Settings" zijn te vinden in de vervolgkeuzelijst "Tasks". (B) Zoom-in van de vervolgkeuzelijst "Presets" waar elke preset kan worden geselecteerd voor het instellen van individuele beeldomstandigheden. (C) Afbeelding met een adequate vergroting om zowel de belichting als het gebied "Focus and Tracking" in het gezichtsveld te passen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figuur 3: Dosisberekeningen. Voorbeelddosisberekeningen voor mogelijke tomogramacquisitieschema's waarbij het dosistempo over vacuüm is gemeten. De twee berekeningen bepalen de blootstellingstijd (en) voor elke kanteling, of het nu gaat om een optimale dosis per kanteling of een optimale totale dosis voor de full tilt-serie. Bij subtomogrammiddeling is het gebruikelijk om een optimale dosis per gekantelde afbeelding te targeten in het bereik van 3,0-3,5 e-/Å2. In beide gevallen zijn de "Fracties (Nr.)" ingesteld op 6 om ~0,5 e-/Å2 dosis per filmframe van de kanteling te bereiken voor voldoende signaal om bewegingscorrectie uit te voeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Figuur 4: Tabblad Atlas. Overzichtsafbeelding van het tabblad "Atlas". De afbeelding is bijgesneden om lege rasterpositieruimten te voorkomen. Het menu "Taken" bevat voorkeuren voor sessie-instellingen en rasterselectieruimten voor individuele selectie van alle geïnventariseerde rasters en een optie om een enkele atlas te verkrijgen nadat de cassette uit de autoloader is verwijderd. Een geselecteerd raster kan opnieuw worden ingesteld en vervolgens opnieuw worden verkregen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Figuur 5: Gekalibreerde beeldverschuivingen. Afbeelding toont een belichtings- en zoekafbeelding. Het rode kruis in de zoekafbeelding is de verschoven markering om de verschuiving tussen belichting en zoekopdracht te corrigeren. Men moet de kalibraties van de beeldverschuiving opnieuw uitvoeren bij het begin van de sessie of na het wijzigen van de voorinstellingen voor de beeldconditie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Figuur 6: Automatische functies en diafragma's. (A) Het tabblad "Automatische functies" toont de vervolgkeuzelijst "Voorinstellingen" en de selectie "Taak". Blauw onderstreept is de "Thon Ring" preset die vereist is voor "Autostigmate" (ook onderstreept in blauw) en "Autocoma". Men moet de respectieve voorinstellingen voor elke taak selecteren en vervolgens op de Startknop drukken. (B) Diafragma's zijn te vinden in de TEM-gebruikersinterface. Selecteer het gewenste "Objectief diafragma" nadat de automatische functies zijn uitgevoerd en voer "Autostigmate" uit met het diafragma in. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Figuur 7: Tomografie tabblad overzicht. Afbeeldingen tonen de Tomo 5.8 gebruikersinterface. (A) Partijposities. De nieuwste functies die in de afbeelding worden weergegeven: de optie "Search Map verkrijgen"; tomogramposities worden weergegeven in atlasweergave met de inzoomoptie; gemarkeerd in de rechterbovenhoek is "Posities selecteren"; hieronder zijn alle vier de posities geselecteerd om de parameters "Update Defocus" te gebruiken. (B) Er worden drie posities geselecteerd op de zoekkaart, met het label 1, 2 en 3. Positie 1 zal geen probleem vormen wanneer "Alles verfijnen" wordt uitgevoerd. Als u echter in een instelling met een hoge doeldichtheid, zoals wanneer lamellenposities zijn geselecteerd, zoals afgebeeld voor positie 2 en positie 3, dan zal "Refine All" de routine "Tracking" en "Focus" uitvoeren op het "Exposure" -gebied van positie 2, waardoor het doel wordt blootgesteld voordat het tomogram wordt verkregen. Het rastertype is R1.2/1.3. Schaalbalk = 1,2 μm. (C) Gegevensverzameling. Geselecteerde posities die zijn ingesteld in "Batchposities" kunnen nu individueel worden verkregen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Figuur 8: Bepalen van de maximale kantelhoek. Figuur toont een stapsgewijze benadering voor het bepalen van het maximale kantelbereik voor tomogramaankopen. (A) 0° overzicht en een zoekkaart in het midden van het rasterplein. Om het kantelbereik te testen, kan de hoek in de tomografiesoftware worden ingesteld met "Set Tilt (°)" door de gewenste waarde te typen en vervolgens op Set te drukken. (B) Het podium is gekanteld naar −60°, wat aantoont dat een hoek van de zoekkaart niet volledig zou worden verworven bij −60°. (C) Het podium is gekanteld tot 60°. Door de gaten te tellen die verdwenen zijn bij ±60°, kan men een idee krijgen van het kantelbereik van een rastervierkant. Schaalbalken = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Figuur 9: emClarity flowchart. Het stroomdiagram beschreef de verschillende stappen voor cryo-subtomogrammiddeling. Schaalstaven = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Figuur 10: Template matching met behulp van emClarity. (A) Een typische micrograaf van apoferritine op een grafeen-gecoat raster. Onscherpte: −3.430 μm. (B) Een plak van het tomogram bedekt met modelpunten na het zoeken naar een sjabloon. (C) Een boven- en (D) een zijprojectiebeeld van modelpunten, wat duidt op een enkele platte laag monodispersed apoferritinedeeltjes. Schaalstaven = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figuur 11: Cryo-ET STA van apoferritine. (A) De laatste kaart na 21 cycli van subtomogramuitlijning. (B) De Fourier shell correlation (FSC) plot van de uiteindelijke kaart met een gerapporteerde resolutie van 2,86 Å, met 38 kegel FSC's. (C) Representatieve dichtheidskaarten (uitgerust met PDB-model 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Monster</td>
			<td>Cryo-ET-type</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Kantelbereik (+/-)</td>
			<td>Kanteltrap (°)</td>
			<td>Onscherp bereik (μm)</td>
			<td>Totale dosis (e-/Å2)</td>
			<td>Resolutie</td>
			<td>Onbewerkte gegevens</td>
			<td>Referentie</td>
		</tr><tr><td>Apoferritine</td>
			<td>Gezuiverd/Moleculair (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & dit artikel</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 Gag</td>
			<td>Gezuiverd/Moleculair (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosoom</td>
			<td>Gezuiverd/Moleculair (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>SARS-CoV-2 piek</td>
			<td>Lamellen/Moleculair (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Neuron axon structuur</td>
			<td>Cellulair (ultrastructureel)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Verzamelparameters voor verschillende cryo-ET-onderzoeken. Studies gericht op de reconstructie van moleculaire details uit gezuiverde of in situ eiwitten in vergelijking met een studie gericht op het oplossen en segmenteren van de ultrastructurele cellulaire kenmerken.
Film 1: Een tomogram van apoferritinemonsters op een normaal EM-raster en vervolgens afgebeeld met een cryo-TEM uitgerust met een camera met ultrahoge resolutie met een compatibel filter. Tilt-series werden verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 54° en een totale dosis van 134 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Film 2: Een tomogram van een primair neuron gekweekt op een EM-raster en vervolgens direct in beeld gebracht met een cryo-TEM uitgerust met een ultrahoge resolutie camera met een compatibel filter. De tilt-serie werd verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 60° en een totale dosis van 120 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Film 3: Een tomogram van een Cyanobacteria op een EM-raster, onderworpen aan FIB-frezen en vervolgens in beeld gebracht met een cryo-TEM uitgerust met een hogesnelheidscamera en een compatibel filter. De kantelseries werden verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 50° en een totale dosis van 120 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: De parameterbestandssjabloon voor het schatten van de onscherpte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Gegevensverzameling en microscoopopinstellingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Lijst van opdrachten in de volgorde van uitvoering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Dit protocol biedt een gemakkelijke toegangsroute naar de steeds populairder wordende maar complexere wereld van cryo-elektronentomografie. Zes cellulaire exemplaren kunnen worden afgebeeld. Instituut in een dicht bij inheemse staat.Micromoleculen kunnen vervolgens met hoge resolutie worden opgelost in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving door crow, et en subatoommiddeling te gebruiken. Begin met het starten van de Tomo five-software vanaf de TEM-server-pc. Start de sessie die is ingesteld door de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen aan te passen op het tabblad Voorbereiding, onder voorinstellingen.Kopieer de parameters van de beeldacquisitie naar alle andere voorinstellingen voor hoge vergroting. Druk op Set "om de belichting op de microscoop in te stellen en get" om de belichtingsinstellingen voor alle andere hoge vergrotingen te krijgen nadat u ze afzonderlijk hebt geselecteerd. Om een atlas te verzamelen, klikt u op de Nieuwe sessie"in de Atlas"tab.Stel de sessievoorkeuren in. Voer het opslagpad en het uitvoerformaat in en druk op toepassen. Selecteer Screening" en vink alle atlassen aan die moeten worden verkregen.Selecteer Close Call Valves"Als de microscoop zonder toezicht is, worden de kolomkleppen gesloten. Om vervolgens de screening te starten, drukt u op de startknop. Inspecteer de enkele of meerdere atlassen op doelen door op het raster in het linkerdeelvenster onder Sessie-instelling te klikken"Klik vervolgens met de linkermuisknop en sleep de muis om rond te bewegen en de middelste scroll om in en uit te zoomen.Kies het raster voor de doelinstellingen. Selecteer het en klik op Sample laden"vanuit de software. Om beeldverschuivingskalibratie uit te voeren, stelt u op het tabblad Automatische functies de voorinstelling in op Eucentrische hoogte"Navigeer naar Auto-Eucentrisch" door trapeling en drukt u op start.Als de functie tijdens het targeten gecentreerd bleef, sla dan de kalibraties van de beeldverschuiving over. Ga anders naar het tabblad Voorbereiding voor het kalibreren van de beeldverschuiving selecteer Imageverschuiving kalibreren en druk op start. Hiermee worden lagere vergrotingen afgestemd op de functie die is gecentreerd bij belichtingsvergroting.Voor het instellen van tomografie start u een nieuwe sessie in Session Setup"voor biologische monsters. Kies Slab like"als het monstertype en selecteer Batch" en Lage dosis"Selecteer vervolgens de map Uitvoerformaat en opslag" . Voeg desgewenst een e-mailontvanger toe en druk op Toepassen"Om doelen in te stellen, gaat u naar de atlaspijl, zoekt u een interessante regio en verplaatst u door de opties te selecteren die met de rechtermuisknop verschijnen.Maak een overzichtsfoto om een goede positie voor eucentrische hoogteverstelling te bevestigen. Druk vervolgens op autoeucentrisch" om de eucentrische kantelingsroutine uit te voeren, verkrijg opnieuw een nieuwe overzichtsafbeelding om de eucentrische hoogte bij te werken. Inspecteer het vierkante overzicht of de verkregen zoekkaart.Ga naar een interessante regio en druk op acquire search. Inspecteer vervolgens de zoekafbeelding als het interessegebied niet gecentreerd is, klik met de rechtermuisknop op de gewenste positie en herhaal de fase verplaatsen hier"en verkrijg de afbeelding. Pas de focus- en trackinggebieden aan.Klik met de linkermuisknop om de tracking- en focusgebieden te slepen. Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op Positie toevoegen"Om automatische functies uit te voeren, controleert u de instellingen om de uitlijningen uit te voeren via het tabblad Automatische functies door de atlas naar een koolstofgebied te navigeren. Breng dat gebied naar eucentrische hoogte en volg de volgorde van uitlijningen zoals beschreven in het tekstmanuscript.Start vervolgens de geautomatiseerde verwerving van het tabblad tomografie. Selecteer de plak Data Acquisition"en stel de gewenste parameters in. Stel parameters voor gegevensverzameling in: kantelstap, maximale positieve hoek, maximale negatieve hoek, volgschema.Selecteer vervolgens Kolomkleppen sluiten" voor het eucentrische hoogteschema. Begin met het voorbereiden van invoerbestanden en mappen. Stel een projectmap in onder de map Project.Maak nog een nieuwe map vaste stapels en bereid de invoerbestanden voor. Tilt serie één vaste kantelserie 1. XF en tilt serie 1.tlt.Om de onscherpte te berekenen, werkt u het parameterbestand bij met de microscoop en beeldparameters. Kopieer een parameterbestand naar de projectmap. Wijzig de naam in param_CTF.M en voer de aangegeven opdracht uit. Controleer vervolgens de CTF-schattingsresultaten. Controleer voor elke stapel de uitgelijnde stapels met behulp van 3D-mod en zorg ervoor dat de fiduciale kralen correct worden gewist.Zorg ervoor dat de handvaardigheid correct is door de aangegeven opdracht uit te voeren. Controleer vervolgens de onscherptewaarde en zorg ervoor dat deze overeenkomt met de theoretische CTF-schatting. Als u de subregio's wilt definiëren, genereert u een bend tomogram.Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Bepaal de grenzen door zes punten Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin en Zmax te kiezen, om één subregio onder de map bin10 te maken, voert u de aangegeven opdracht uit. Voer vervolgens deeltjesselectie uit voor elke subregio.Voer voor de apoferritine-dataset een sjabloonzoekopdracht uit in bin zes. Wijzig de onderstrepingshoek van de sjabloon. Zoekparameters om de hoek, het bereik en de intervallen te bepalen voor zoeken in vlak of buiten het vlak in graden.Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Verwijder de onjuiste deeltjes met behulp van 3D mod onder de map. Convmap_wedge_Type2_bin6. Voer de aangegeven opdracht uit.Initialiseer vervolgens het project. Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit om een database te maken voor EM-helderheid, AppoF.mat. Voer een reconstructie van het tomogram uit vóór sub-tomomiddeling en uitlijning om CTF-gecorrigeerde subregiotomogrammen te genereren bij bin4, voer de aangegeven opdracht uit.Vervolgens, om sub tomo-gemiddelden en uitlijning uit te voeren, voert u de gemiddelden uit met behulp van de CTF-gecorrigeerde subtelegrammen vanaf bin4. Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Blijf uitlijningen uitvoeren en voer de opdracht uit.Reinig de overlappende deeltjes door de aangegeven opdracht uit te voeren. Voer de definitieve reconstructie uit door de twee halve datasets te combineren. Voer in de projectmap de aangegeven opdrachten uit.Overzicht van de tomografieworkflow voor de cellulaire en moleculaire tomografie wordt hier getoond voor cellulaire en lamellenmonsters, de strategie voor gegevensverzameling hangt grotendeels af van het monster en het doel van de beeldvormingsstudie. Verzamelparameters voor verschillende cryo ET-studies worden hier weergegeven. Representatieve tomogrammen van moleculaire monsters zoals apoferritine, dunne cellulaire processen en gecentreerde ionenbundel gefreesde lamellen van het dikke cellulaire monster worden hier weergegeven.Structurele analyse met hoge resolutie kan helpen om bindingsplaatsen voor medicijndoelen te onthullen en tomografie en subtomograle gemiddelden hebben ook bijgedragen aan de ontwikkeling van vaccins tegen SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

Zeewater Bemonstering en Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Verzameling en identificatie van stuifmeel van honingbijenkolonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Constructie van een realistisch, whole-body, driedimensionaal paardenskeletmodel met behulp van computertomografiegegevens

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...