Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
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Nous remercions Diamond Light Source pour l’accès et le soutien des installations cryo-EM du Centre national de bio-imagerie électronique (eBIC) du Royaume-Uni, financé par le Wellcome Trust, MRC et BBRSC. Nous tenons également à remercier Andrew Howe pour l’acquisition du tomogramme Apoferritin (film 1), Ishika Kumar pour la préparation et l’acquisition du tomogramme neuronal (film 2) et Craig MacGregor-Chatwin pour le tomogramme lamellaire cyanobactérien (film 3).

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	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. 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Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Tomo5 La description du flux de travail du logiciel de tomographie met en évidence une méthode potentielle et la plus rationalisée pour une configuration de session de tomographie par lots (à distance). Bien que le logiciel soit facile pour les débutants, une expérience initiale de cryo-EM et une compréhension de base de la tomographie peuvent aider à la configuration. Les étapes critiques sont mises en évidence dans le protocole et devraient aider à résoudre le problème même si une approche de configuration différente a été utilisée. L’avancement du logiciel facilitera la collecte de données (à distance) et rendra cryo-ET plus accessible à une large base d’utilisateurs. Quelques conseils et astuces qui peuvent vous aider à résoudre les problèmes fréquemment rencontrés sont décrits ci-dessous.
Un point important à discuter est le choix des grilles car, lors de l’inclinaison de l’échantillon à ±60°, les barres de grille à forte inclinaison peuvent obscurcir la vue (Figure 8). Sur une grille TEM, le maillage fait référence au nombre de carrés de grille par unité de longueur de la grille. Les grands nombres de maillage ont plus de carrés de grille par unité de longueur, une densité plus élevée de carrés de grille et des carrés de grille plus petits, c’est-à-dire qu’une grille de 400 mailles a des carrés plus petits qu’une grille de 200 mailles. Un bon choix de grilles pour la tomographie est les grilles à 200 mailles ou 300 mailles. Comme le montre la figure 8, la surface disponible pour la collecte est réduite lorsque la grille est inclinée. À ±60° d’inclinaison, une grille de 300 mailles aura un petit champ de vision sur lequel un tomogramme complet peut être acquis. Les avantages des grilles à 200 mailles sont que les carrés de grille plus grands rendent la tomographie moléculaire plus rapide, et avec l’augmentation de la surface des carrés de grille, un carré sera probablement suffisant pour une collecte de nuit. L’inconvénient est que les grilles à 200 mailles sont plus fragiles, donc la manipulation et l’écrêtage demandent plus de finesse.
De plus, si vous utilisez un film de support troué (voir Tableau des matériaux) sur des grilles EM, l’espacement des trous doit être pris en compte pour la configuration de la zone de mise au point et de suivi par rapport à la région d’exposition. Idéalement, le diamètre du faisceau au grossissement souhaité devrait être suffisamment petit pour couvrir la zone de carbone adjacente à la zone d’exposition le long de l’axe d’inclinaison pour une configuration optimale et rapide. De cette façon, les régions d’intérêt potentielles dans chaque trou peuvent être acquises.
Comme la routine de hauteur eucentrique du logiciel n’est actuellement pas aussi robuste, comme la routine serialEM, les conseils suivants peuvent contourner ce problème. Si la détermination de la hauteur eucentrique échoue en utilisant le préréglage de hauteur eucentrique, on peut utiliser le préréglage de vue d’ensemble à la place et réexécuter « Auto-eucentrique par inclinaison de scène »; Cela peut résoudre les problèmes si la hauteur eucentrique est loin de 0. Si cela réussit, on peut relancer « Auto-eucentrique par inclinaison de la scène » avec des préréglages « Hauteur eucentrique » pour améliorer la précision. En cas d’échec, on peut exécuter « Auto-Eucentric by beam tilt » avec le préréglage eucentrique de hauteur, puis relancer « Auto-Eucentric by stage tilt » ou régler manuellement la hauteur z consolidée par « Auto-Eucentric by beam tilt » dans l’interface utilisateur TEM sous les paramètres « Stage ». Dans le cas où des grilles avec un motif répétitif de trous sont utilisées, elles peuvent empêcher l’identification d’un seul pic de corrélation croisée. On peut essayer de modifier la hauteur eucentrique prédéfinie à un décalage de flou inférieur tel que -25 μm et / ou un temps d’exposition plus court pour réduire la corrélation croisée des motifs de trou. D’autre part, l’utilisation de grilles de dentelle / lamelles peut ne pas fournir un signal suffisant pour un pic de forte corrélation croisée. On peut essayer de modifier la hauteur eucentrique prédéfinie pour un décalage de défocalisation plus grand tel que -75 μm et / ou un temps d’exposition prolongé pour améliorer le pic de corrélation croisée. Une autre option consiste à ajuster les paramètres de filtre d’image; ils se trouvent dans l’onglet « Préparation ». Les options permettant d’ajuster les paramètres de filtre peuvent être définies pour un grossissement faible (Vue d’ensemble/Gridsquare), moyen (Hauteur eucentrique) et élevé (Suivi/Mise au point) afin de trouver le pic de corrélation croisée optimal pour chaque préréglage. L’entrée requise est une image, c’est-à-dire à 0° et une à 5°, suivie d’un clic sur Comparer pour comparer les deux images. La valeur de départ recommandée pour la longueur d’onde la plus longue est un quart de la barre d’échelle dans l’image et pour la longueur d’onde la plus courte est un quarantième de la barre d’échelle. Si le pic n’est pas identifié de manière robuste, on peut optimiser les paramètres jusqu’à ce qu’un pic convaincant puisse être trouvé. Il n’est pas nécessaire de réacquérir des images à chaque fois; il suffit d’appuyer sur « Comparer ». Si TOMO ne parvient toujours pas à trouver automatiquement la hauteur eucentrique, l’étalonnage manuel de la hauteur eucentrique peut être utilisé. Il faut centrer sur un cristal de glace raisonnablement grand dans le grossissement général dans l’onglet « Préparation », puis aller au « Contrôle de scène » de l’interface utilisateur TEM, régler alpha à -30° et ajuster la valeur z de l’étape pour recentrer le cristal à l’aide de l’image fluorescente de l’écran. La sélection des paramètres « Haute résolution » et « Contraste élevé » dans l’interface utilisateur de la GDT simplifiera cette tâche (boutons au bas de la fenêtre de l’écran fluorescent). En option, s’il y a accès à une caméra avec le mode live, cela peut être utilisé pour déterminer la hauteur eucentrique; Ce sera plus facile que sur l’écran fluorescent.
Les plus grandes limitations dans les versions Tomo5 antérieures à 5.8 sont les montages de grossissement moyen manquants, le schéma symétrique de dose manquant et les problèmes liés à la recherche de hauteur eucentrique. Ceux-ci existent dans serialEM, un logiciel gratuit avec un développement rapide et un soutien communautaire, une routine de hauteur eucentrique robuste et la possibilité de scripter, c’est-à-dire un schéma symétrique de dose personnalisé. À partir de la version 5.8 dans Tomo5, le problème le plus fréquemment rencontré pour trouver la hauteur eucentrique, c’est-à-dire une boucle infructueuse autour de la valeur z cible, a été résolu en implémentant l’option de définir un critère d’acceptation de hauteur eucentrique. Cependant, avec différents types de grille et d’échantillons, il est fortement recommandé d’ajuster les paramètres du filtre d’image pour refléter les conditions d’imagerie uniques des séances individuelles et de donner le meilleur pic de corrélation croisée possible pour trouver la hauteur eucentrique et pour que la zone de mise au point et de suivi fonctionne de manière fiable lors de l’acquisition du tomogramme.

Dans l’ensemble, de nombreuses installations se sont rapidement adaptées aux opérations à distance pendant la pandémie. Le logiciel Tomo5 offre un accès facile et un itinéraire convivial vers la tomographie qui est bien adapté à l’utilisation à distance. Les progrès réalisés dans le logiciel continueront sans aucun doute à rendre les collectes de données à distance et la collecte de tomographie en général plus courantes dans la communauté.
emClarity Comme emClarity utilise une méthode de sélection de particules basée sur un modèle, il a besoin d’un modèle pour l’objet qui vous intéresse. La cueillette des particules (étape 2.6) est très sensible et essentielle à la structure finale. Avant de faire la moyenne et l’alignement (étape 2.9), il faut s’assurer de vérifier soigneusement et de supprimer manuellement les faux positifs. Lorsqu’un modèle n’est pas disponible, emClarity peut ne pas être facile à utiliser, mais il est possible d’utiliser d’autres logiciels, par exemple, Dynamo37 et PEET48, pour créer un modèle initial.
Pour les échantillons hétérogènes, emClarity est équipé d’une méthode de classification qui permet aux utilisateurs de se concentrer sur des caractéristiques spécifiques avec différentes échelles. Il est utile d’exécuter quelques cycles d’alignements avant la classification et de l’exécuter à un regroupement plus élevé (tel que le bac 4 ou le bac 3).
La version à jour du logiciel (V1.5.3.11) a des mises à jour significatives par rapport à la première version (V1.0)17. Ceux-ci comprennent, sans toutefois s’y limiter, un contrôle de la maniabilité lors de l’estimation de la FCE (étape 2.3); symétrie pour les alignements (CX, I, I2, O); calcul des fonctions d’échantillonnage 3D par particule (3DSF); un passage à MATLAB 2019a pour la compatibilité et la stabilité ; et la reconstruction à l’aide des images de projection brutes (cisTEM). Le logiciel continuera de s’améliorer pour divers échantillons, et les annonces les plus récentes peuvent être consultées en ligne (voir le tableau des matériaux).

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est largement connue pour avoir connu une période de renaissance, l’accélérant pour devenir un outil central et central en biologie structurale. Le développement et l’utilisation de détecteurs d’électrons directs 1,2,3, l’amélioration des microscopes et des sources d’électrons 3,4,5, l’amélioration de l’automatisation et du débit 6,7,8,9 et les progrès informatiques de l’analyse monoparticulaire10,11,12,13 ,14 et la tomographie15,16,17 sont tous, en partie, responsables du succès récent de la technique. Ces moteurs technologiques ont développé la capacité de cryo-EM à résoudre des structures macromoléculaires biologiques dans des conditions cryogéniques et natives. Les résolutions facilement réalisables sont suffisantes pour une modélisation atomiquement précise et ont amené la technique à l’avant-garde de l’arène de la biologie structurale. Une approche réductionniste pour exprimer et purifier une cible biologique d’intérêt a depuis longtemps fait ses preuves en cristallographie macromoléculaire (MX) pour la recherche biologique fondamentale, la découverte de médicaments et la science translationnelle. Dans la même approche, cryo-EM peut désormais fournir des résultats parallèles aux études MX haute résolution. Le succès majeur actuel dans la branche cryo-EM de la biologie structurale est appelé analyse monoparticulaire (SPA), qui acquiert des images de projection 2D typiquement d’un échantillon de protéine purifiée18 pour obtenir des milliers de vues d’une macromolécule biologique19. Ces images (1) contiennent des informations provenant d’une gamme de vues qui représentent pleinement les orientations de la cible dans l’espace 3D et (2) capturent l’hétérogénéité conformationnelle de l’objet, qui peut ensuite être séparée et étudiée.
Une approche alternative à l’acquisition de ces images de projection 2D d’échantillons biologiques, même in situ et sans purification, est la cryo-tomographie électronique (cryo-ET). Cryo-ET prend une série d’images du même objet à des angles inclinés en faisant tourner mécaniquement l’échantillon. Ainsi, les projections 2D recueillies en SPA, représentant les poses angulaires de la molécule d’intérêt, sont intrinsèquement collectées dans le cadre de l’expérience d’imagerie cryo-ET20. Les séries d’inclinaison tomographique sont ensuite reconstruites en un tomogramme contenant des représentations 3D des complexes macromoléculaires imagés. La nature de la collecte de données tomographiques diminue, dans une certaine mesure, la dépendance à l’égard de la moyenne pour obtenir une représentation 3D complète d’une molécule à partir d’une collection d’images 2D. Cependant, en raison de la conception des scènes actuelles, l’échantillon est généralement incliné de -60° à +60°, laissant un coinmanquant 21 d’informations dans la reconstruction tomographique 3D.
Les reconstructions 3D dans un seul tomogramme ont alors un coin d’information manquant et un faible signal au bruit. Les macromolécules individuelles peuvent être extraites sous forme de sous-tomogrammes et moyennées ensemble pour résoudre ce problème. Lorsque chaque macromolécule d’un sous-tomogramme se trouve dans une orientation différente, le coin manquant est orienté différemment dans chaque sous-tomogramme de l’objet cible, de sorte qu’une moyenne sur plusieurs copies remplit les informations en raison du coin manquant. Les développements récents dans le traitement d’images ont également tenté de former des réseaux neuronaux d’intelligence artificielle pour combler le coin manquant avec des données significatives22. Ce processus de moyenne augmente également le signal au bruit, semblable à l’objectif de moyenne dans l’analyse de particules uniques, de sorte que la qualité et la résolution de la reconstruction s’améliorent. Si la molécule d’intérêt possède une symétrie, cela aussi peut être défini et utilisé lors de la moyenne, améliorant encore la résolution de la reconstruction. L’extraction de volumes 3D d’une macromolécule d’un tomogramme dans un ensemble de sous-tomogrammes et leur traitement ultérieur sont connus sous le nom de moyenne des sous-tomogrammes (STA)23. Lorsque chaque sous-tomogramme représente une copie unique de la molécule étudiée, toute hétérogénéité structurelle peut être interrogée à l’aide du flux de travail STA. Comme couramment utilisé dans le flux de travail SPA, les techniques de classification peuvent être utilisées pendant STA pour disséquer les états conformationnels du complexe d’intérêt. En plus de STA permettant une reconstruction à haute résolution en cryo-ET, cette approche fait de la technique un outil puissant pour interroger les mécanismes structurels des macromolécules dans leur environnement cellulaire natif ou de cibles souvent non sensibles au SPA24,25,26.
La tomographie électronique a une longue histoire de détermination de l’ultrastructure 3D d’échantillons cellulaires à température ambiante27. L’acquisition de vues par inclinaison physique de l’échantillon fournit suffisamment d’informations pour la reconstruction 3D d’un objet à des échelles de longueur cellulaire et est particulièrement importante lorsque les structures cellulaires n’ont pas la régularité nécessaire pour faire la moyenne. Les cellules peuvent également être congelées sur des substrats pour l’imagerie cryo-ET aux bords cellulaires où l’échantillon est suffisamment mince pour être transparent aux électrons. Dans ces conditions, STA peut être utilisé pour déterminer des structures macromoléculaires dans un environnement cellulaire, mais lorsque l’échantillon est suffisamment mince pour être transparent aux électrons28. Cependant, lorsqu’il est combiné avec d’autres techniques de préparation, y compris la cryo-corrélation de la lumière et la microscopie électronique (cryo-CLEM) et le broyage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB), le cryo-ET peut être utilisé pour imager à l’intérieur de cellules entières dans des conditions cryogéniques29. Cela réunit la puissance de cryo-ET pour étudier l’ultrastructure cellulaire avec la puissance de STA pour déterminer les structures des complexes macromoléculaires in situ tout en identifiant leur emplacement cellulaire30 et en fournissant des instantanés de complexes engagés dans des processus dynamiques31. La capacité de la technique à imager des spécimens cellulaires et à utiliser STA dans plusieurs études a mis en évidence la puissance de la technique pour résoudre des structures macromoléculaires in situ, même à des résolutions comparables à SPA32. Un autre avantage réside dans la connaissance de l’emplacement d’origine de la macromolécule, représentée par la reconstruction 3D finale classée dans le tomogramme30. Par conséquent, la structure macromoléculaire peut être corrélée avec l’ultrastructure cellulaire. Ces observations sur des échelles de longueur conduiront probablement à des résultats importants où les mécanismes structurels peuvent être corrélés avec les changements cellulaires dans le contexte des études fonctionnelles.
Cryo-ET et STA permettent la collecte de données dans trois flux de travail principaux : moléculaire, cellulaire et tomographie lamellaire. Les structures des complexes macromoléculaires purifiés peuvent être déterminées par cryo-ET par tomographie moléculaire. La détermination des structures protéiques dans leur environnement cellulaire où la cellule est suffisamment mince peut être décrite comme la tomographie cellulaire. Plus récemment, avec le développement du ciblage cryogénique et du broyage, ces mêmes techniques peuvent être appliquées dans les flux de travail de tomographie lamellaire pour déterminer les structures protéiques profondément à l’intérieur de la cellule dans leur environnement natif tout en révélant le contexte cellulaire dans lequel ces protéines sont observées. Différentes stratégies de collecte de données peuvent être utilisées en fonction des progiciels disponibles et, surtout, en fonction des exigences du spécimen. Les échantillons moléculaires ou non adhérents sur une grille TEM en cuivre d’une protéine purifiée nécessitent généralement moins de manipulation et, par conséquent, restent plats et intacts dans les cas idéaux. Les tomogrammes électroniques peuvent facilement être configurés en série sur une grille de carbone troué pour acquérir rapidement des dizaines à des centaines de tomogrammes de manière systématique. Le moyen le plus simple pour les utilisateurs de mettre en place des échantillons de tomographie moléculaire où les protéines sont abondamment présentes sur la grille serait d’utiliser Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D utilisé dans la présente étude, voir Tableau des matériaux). D’autres logiciels de tomographie tels que Leginon9 et serialEM6 sont également disponibles; Ils offrent plus d’options de configuration pour des approches plus personnalisées pour la collecte de données, mais sont plus complexes et peuvent donc être plus difficiles à naviguer, en particulier pour les utilisateurs novices en tomographie et les utilisateurs accédant à leur session à distance. Pour une installation avec une base d’utilisateurs large et diversifiée, Tomo5 est facile à utiliser dans un environnement distant et à former les utilisateurs. Pour les cellules adhérentes, les grilles nécessitent généralement plus d’étapes de manipulation, et la nécessité d’utiliser des grilles en or fragiles augmente la nécessité d’améliorer les soins dans les stratégies de manipulation et de collecte de données. Pour faciliter la recherche d’une région cellulaire d’intérêt et éviter l’occlusion de la grille elle-même à des angles d’inclinaison élevés, il est également avantageux d’utiliser des maillages plus grands, mais au prix qu’ils sont intrinsèquement plus fragiles. Pour les échantillons de lamelles, la fragilité de l’échantillon est déterminée par la qualité de la lamelle, qui peut être variable. Ces facteurs augmentent le temps de configuration et les considérations, mais l’adaptabilité et la robustesse accrues rendent Tomo5 adapté à ce type de collecte de données. Toutefois, il existe des scénarios de collecte de données spécialisés pour chaque flux de travail. BISECT et PACE-tomo (tous deux exécutés en SerialEM) introduisent la possibilité de décaler l’image de faisceau scénarisée lors de l’acquisition de la tomographie pour augmenter la vitesse de collecte du tomogramme28, en particulier en tomographie moléculaire. Les montages à grossissement moyen (MMM) dans SerialEM 6,7,33 permettent de mieux identifier et cibler avec précision les caractéristiques moléculaires dans tous les flux de travail, bien que, au moment de la rédaction, ces fonctionnalités commencent à être implémentées dans Tomo5.
Comme SPA, cryo-ET et STA deviennent de plus en plus accessibles grâce aux améliorations apportées aux logiciels d’acquisition et à une multitude de progiciels disponibles pour le sous-tomogramme avec une moyenne de 16,17,32,34,35,36,37,38. En outre, pendant la pandémie, l’accès à distance à l’instrumentation cryo-EM est devenu essentiel à la poursuite du fonctionnement des installations nationales telles que le Centre de bio-imagerie électronique (eBIC) à Diamond Light Source (DLS), au Royaume-Uni. Ces développements ont rendu le cryo-ET plus accessible et robuste pour les chercheurs souhaitant utiliser la technique. Une fois les données acquises, STA est un outil essentiel d’analyse d’objets récurrents pour obtenir une reconstruction à résolution maximale et permettre la classification de l’hétérogénéité macromoléculaire. Le protocole actuel vise à fournir une présentation détaillée de la préparation d’un microscope cryo-TEM pour la collecte de données cryo-ET et de la façon d’effectuer la moyenne des sous-tomogrammes en utilisant emClarity sur un ensemble de données de tomographie moléculaire de l’apoferritine à titre d’exemple. L’utilisation d’emClarity (logiciel pour la cryotomographie électronique à haute résolution et la moyenne des sous-tomogrammes, voir Tableau des matériaux) nécessite l’exécution de scripts à partir de la ligne de commande, de sorte qu’un niveau de familiarité avec les systèmes Linux/UNIX est supposé.
La connexion à distance dépend de l’environnement réseau de chaque institut/établissement. Chez eBIC, le système distant utilise des programmes qui permettent la collecte de données à distance sur la configuration réseau spécifique utilisée chez Diamond. La connexion à distance au microscope est facilitée par deux plates-formes : NoMachine et TeamViewer (voir Tableau des matériaux). En utilisant le programme NoMachine, l’utilisateur peut se connecter à un bureau Windows distant. Le bureau Windows distant fourni par NoMachine réside sur le même réseau que le microscope et, par conséquent, agit comme un PC de support virtuel pour le microscope. À partir du PC de support virtuel, l’utilisateur se connecte au microscope via TeamViewer fournissant un accès direct et un contrôle au PC de microscope exécutant TUI et Tomo.
Le présent protocole comprend deux parties (étape 1 et étape 2). L’étape 1 se concentre sur l’acquisition de données cryo-ET à distance à l’aide de Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D). La visite guidée d’une session (à distance) capture des images à des grossissements de plus en plus élevés pour permettre à l’utilisateur de diriger le logiciel de tomographie vers des zones de spécimens pour la collecte de données tomographiques. La figure 1 résume ce processus. L’étape 2 détaille le traitement des données cryo-ET STA à l’aide d’emClarity (logiciel pour la cryotomographie électronique haute résolution et la moyenne des sous-tomogrammes). La figure 9 résume ce processus.
Le protocole est destiné à un public distant. Il suppose que la personne physiquement au microscope et au chargement des échantillons a effectué les alignements directs et pris soin du réglage de la caméra et de l’acquisition de référence. Pour ce protocole, un système de lentilles à trois condensateurs avec un chargeur automatique est supposé. Pour plus de directives détaillées sur le logiciel de tomographie, un manuel détaillé du fabricant est disponible dans le bouton Démarrer de Windows à partir duquel le logiciel a été chargé.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

La cryotomographie électronique (cryo-ET) a pris de l’ampleur ces dernières années, en particulier depuis l’introduction des détecteurs d’électrons directs, des stratégies d’acquisition automatisées améliorées, des techniques préparatoires qui élargissent les possibilités de ce que le microscope électronique peut imager à haute résolution à l’aide de cryo-ET et un nouveau logiciel de moyenne de sous-tomogrammes. De plus, l’acquisition de données est devenue de plus en plus rationalisée, ce qui la rend plus accessible à de nombreux utilisateurs. La pandémie de SRAS-CoV-2 a encore accéléré la collecte de données de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à distance, en particulier pour la cryo-EM à particule unique, dans de nombreuses installations dans le monde, offrant aux utilisateurs un accès ininterrompu à des instruments de pointe pendant la pandémie. Avec les progrès récents de Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D), la collecte de données cryo-ET à distance est devenue robuste et facile à manipuler de n’importe où dans le monde. Cet article vise à fournir une procédure détaillée, à partir de la configuration de la collecte de données dans le logiciel de tomographie pour le processus d’une session de collecte de données cryo-ET (à distance) avec dépannage détaillé. Le protocole de collecte de données (à distance) est complété par le flux de travail pour la détermination de la structure à une résolution quasi atomique par sous-tomogramme moyennant avec emClarity, en utilisant l’apoferritine comme exemple.

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Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Le présent protocole décrit l’acquisition à distance de données par cryotomographie électronique à haute résolution à l’aide de Tomo5, ainsi que le traitement ultérieur des données et la moyenne des sous-tomogrammes à l’aide d’emClarity. L’apoferritine est utilisée comme exemple pour illustrer des processus détaillés étape par étape pour obtenir une structure cryo-ET à une résolution de 2,86 Å.

Cryotomographie électronique Collecte de données à distance et moyenne par sous-tomogramme

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Ce protocole offre une voie d’accès facile dans le monde de plus en plus populaire mais complexe de la cryotomographie électronique. Six spécimens cellulaires peuvent être imagés. Institut dans un état proche de l’état d’origine.Les micromolécules peuvent ensuite être résolues à haute résolution dans leur environnement cellulaire natif en utilisant la moyenne CROW, ET et sous-atome. Commencez par démarrer le logiciel Tomo five à partir du PC serveur TEM. Démarrez la session configurée en ajustant les paramètres d’acquisition d’image dans l’onglet de préparation, sous préréglages.Copiez les paramètres d’acquisition d’image dans tous les autres préréglages à fort grossissement. Appuyez sur Régler"pour régler l’exposition au microscope et Get"pour obtenir les paramètres d’exposition sur tous les autres grossissements élevés après les avoir sélectionnés individuellement. Pour collecter un atlas, cliquez sur l’onglet Nouvelle session dans l’Atlas.Définissez les préférences de session. Entrez le chemin de stockage et le format de sortie et appuyez sur Appliquer. Sélectionnez Screening » et cochez tous les atlas à acquérir.Sélectionnez Close Call Valves"Si le microscope n’est pas supervisé, cela fermera les vannes de colonne. Ensuite, pour démarrer la projection, appuyez sur le bouton de démarrage. Inspectez les atlas à la recherche de cibles simples ou multiples en cliquant sur la grille dans le panneau de gauche sous Configuration de la session"Cliquez avec le bouton gauche de la souris et faites glisser la souris pour vous déplacer et faites défiler du milieu pour effectuer un zoom avant et arrière.Choisissez la grille pour la configuration cible. Sélectionnez-le et cliquez sur Charger l’échantillon « à l’intérieur du logiciel. Pour effectuer l’étalonnage du décalage de l’image, dans l’onglet Fonctions automatiques, réglez le préréglage sur Hauteur eucentrique"Naviguer vers l’eucentrisme automatique"par inclinaison de la scène, puis appuyez sur Démarrer.Si la fonction est restée centrée pendant le ciblage, ignorez les étalonnages de décalage de l’image. Sinon, allez dans l’onglet Préparation « pour calibrer le décalage de l’image, sélectionnez Calibrer le décalage de l’image"et appuyez sur Démarrer. Cela alignera les grossissements inférieurs sur la caractéristique centrée sur le grossissement de l’exposition.Pour la configuration de la tomographie, démarrez une nouvelle session dans Configuration de la session"pour les échantillons biologiques. Choisissez Slab comme"comme type d’échantillon et sélectionnez Batch"et Low Dose"Sélectionnez ensuite le dossier Format de sortie et stockage ». Si vous le souhaitez, ajoutez un destinataire d’e-mail et appuyez sur Appliquer"Pour configurer les cibles, accédez à la flèche de l’atlas, recherchez une région d’intérêt et déplacez-vous en sélectionnant les options qui apparaissent avec un clic droit.Prenez une image de vue d’ensemble pour confirmer une bonne position pour le réglage de la hauteur eucentrique. Appuyez ensuite sur autoeucentric"pour exécuter la routine d’inclinaison eucentrique par étage, réacquérir une nouvelle image de vue d’ensemble pour mettre à jour la hauteur eucentrique. Inspectez la vue d’ensemble du carré ou la carte de recherche acquise.Déplacez-vous vers une région d’intérêt et appuyez sur acquérir la recherche. Ensuite, inspectez l’image de recherche si la région d’intérêt n’est pas centrée, faites un clic droit à la position souhaitée et répétez l’étape Déplacer ici « et acquérir l’image. Ajustez les zones de mise au point et de suivi.Cliquez avec le bouton gauche de la souris pour faire glisser les zones de suivi et de mise au point. Une fois tous les paramètres définis, appuyez sur Ajouter une position"Pour effectuer des fonctions automatiques, vérifiez les paramètres pour effectuer les alignements via l’onglet Fonctions automatiques » en naviguant dans l’atlas vers une zone de carbone. Amenez cette zone à la hauteur eucentrique et suivez l’ordre des alignements décrit dans le manuscrit du texte.Ensuite, lancez l’acquisition automatisée de l’onglet tomographie. Sélectionnez la dalle d’acquisition de données et définissez les paramètres souhaités. Configurez les paramètres d’acquisition de données: pas d’inclinaison, angle positif maximal, angle négatif maximal, schéma de suivi.Sélectionnez ensuite Fermer les vannes à colonne » pour le schéma de hauteur eucentrique. Commencez par préparer les fichiers d’entrée et les répertoires. Créez un dossier de projet sous le dossier Projet ».Créez un autre nouveau dossier piles fixes et préparez les fichiers d’entrée. Série d’inclinaison une série d’inclinaison fixe 1. XF et tilt series 1.tlt.Pour calculer la défocalisation, mettez à jour le fichier de paramètres avec les paramètres du microscope et de l’imagerie. Copiez un fichier de paramètres dans le dossier du projet. Changez son nom en param_CTF.M et exécutez la commande indiquée. Ensuite, vérifiez les résultats de l’estimation CTF. Pour chaque pile, vérifiez les piles alignées à l’aide de 3D mod et assurez-vous que les perles fiduciaires sont effacées correctement.Assurez-vous que la manipulation est correcte en exécutant la commande indiquée. Vérifiez ensuite la valeur de défocalisation et assurez-vous qu’elle correspond à l’estimation théorique du CTF. Pour définir les sous-régions, générez un tomogramme courbé.Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Déterminez les limites en choisissant six points Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin et Zmax, pour créer une sous-région sous le dossier bin10, exécutez la commande indiquée. Ensuite, exécutez la sélection des particules pour chaque sous-région.Pour l’ensemble de données sur l’apoferritine, effectuez une recherche de modèle à bin six. Modifiez l’angle de soulignement du modèle. Paramètres de recherche pour déterminer l’angle, la plage et les intervalles pour la recherche dans le plan ou hors plan en degrés.Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Supprimez les particules incorrectes à l’aide de 3D mod sous le dossier. Convmap_wedge_Type2_bin6. Exécutez la commande indiquée.Ensuite, initialisez le projet. Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée pour créer une base de données pour la clarté EM, AppoF.mat. Effectuez la reconstruction du tomogramme avant la moyenne et l’alignement du sous-tomo pour générer des tomogrammes de sous-région corrigés CTF à bin4, exécutez la commande indiquée.Ensuite, pour effectuer la moyenne et l’alignement subtom, effectuez la moyenne à l’aide des sous-télégrammes corrigés CTF à partir de bin4. Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Continuez à effectuer des alignements et exécutez la commande.Nettoyez les particules superposées en exécutant la commande indiquée. Effectuez la reconstruction finale en combinant les deux demi-ensembles de données. Dans le dossier du projet, exécutez les commandes indiquées.Un aperçu du flux de travail tomographie pour la tomographie cellulaire et moléculaire est présenté ici pour les échantillons cellulaires et lamelles, la stratégie de collecte de données dépend en grande partie de l’échantillon et de l’objectif de l’étude d’imagerie. Les paramètres de collecte pour plusieurs études cryo ET sont présentés ici. Des tomogrammes représentatifs d’échantillons moléculaires tels que l’apoferritine, les processus cellulaires minces et les lamelles broyées par faisceau d’ions focalisés du spécimen cellulaire épais sont présentés ici.L’analyse structurelle à haute résolution peut aider à révéler les sites de liaison pour les cibles médicamenteuses et la tomographie et la moyenne sous-tomograle ont également contribué au développement de vaccins contre le SRAS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

L&#39;échantillonnage d&#39;eau de mer et de Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Recherche

Biologie

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

À faire et à ne pas faire de cryo-microscopie électronique: Notions sur la préparation de l&#39;échantillon et de collecte de données de haute qualité pour la reconstruction 3D macromoléculaire

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisation de Compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par haute tension Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Collecte et identification du pollen des colonies d’abeilles mellifères

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Construction d’un modèle squelettique équin réaliste, en trois dimensions, à l’aide de données de tomodensitométrie

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Stratégies d’optimisation de l’acquisition de données de tomographie électronique cryogénique

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...